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地衣芽孢杆菌的分离和鉴定

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布帕提买木·麦麦提潘姣姣阿迪莱·卡哈曼伍麦尔·麦海提陈荟旭张秋林李莲瑞

摘要：为了從土壤中分离得到地衣芽孢杆菌，开展后续研究，试验采集塔里木盆地的土壤进行细菌培养，采用台盼蓝平板方法，对分离培养得到的单菌落进行生物学特性研究、生理生化试验和16S rDNA鉴定。根据《伯杰细菌鉴定手册》，初步鉴定为芽孢杆菌，提取DNA进行PCR扩增并送测序。结果表明，从塔里木盆地土壤中分离得到的细菌为地衣芽孢杆菌，说明该土壤中存在地衣芽孢杆菌，并为后续进一步研究及应用奠定基础。

关键词：土壤;分离和鉴定;16S rDNA;地衣芽孢杆菌

中图分类号：S-3

文献标识码：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20200915005

收稿日期：2020-08-17

基金项目：大学生创新项目（项目编号：201810757029）

作者简介：布帕提买木·麦麦提（1996-），女，硕士在读。研究方向：动物性食品卫生与安全;通信作者李莲瑞（1968-），女，博士，教授。研究方向：动物性食品卫生与安全。

地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）为革兰氏阳性菌，广泛分布于微生物混合培养物中[1]。呈杆状，芽孢为椭圆形，孢囊稍膨大，为非致病性菌，细菌最适生长温度约为50℃，酶的最适生长温度为37℃。地衣芽胞杆菌耐热、含酶量多、产酶量高的优良特性被广泛应用于工业生产中，主要用来生产淀粉酶[2]及蛋白酶[3]。芽孢杆菌具有耐酸、耐盐、耐高温等特点，这使得其可以在条件不利的情况下形成芽孢，自我保护，并在环境适宜的条件下复活。地衣芽孢杆菌在代谢过程中能产生多种酶和活性物质，具有益生保健[4]，降解农药[5]和净化水体[6]的作用。为了解塔里木盆地土壤中是否存在地衣芽孢杆菌，本试验从塔里木盆地的1份土壤中筛选出1株镜检有芽孢的单菌落，对该菌株进行分离纯化，经过生理生化实验鉴定、16S rDNA基因测序，最终鉴定为地衣芽孢杆菌，且为后续开展地衣芽孢杆菌的应用研究奠定基础。

1?材料

1.1?样品采集

新疆塔里木大学校园肥沃菜地距地表20～80cm土样。

1.2?主要试验仪器

恒温培养箱（型号为GHP-9080），购自上海一恒科学仪器有限公司;小型台式高速离心机（型号为Eppendorf 5453），购自北京创世云博科技发展有限公司;洁净工作台（型号为SW-CJ-2ED），购自上海五久自动化设备有限公司;显微镜（型号为尼康 ECLIPSE Ci-L），购自成贯仪器（上海）有限公司;摇床（型号为ZWY-2102C），购自济南宇晗医疗器械有限公司;加热制冷循环器（型号为JULABO Labortechnik GmbH F12），购自优莱博技术（北京）有限公司。

1.3?试验药品

盐酸、磷酸二氢钾、氢氧化钠、明胶、氯化钠、七水硫酸镁、淀粉、硫酸铵、卢哥氏碘液、硝酸钾、格里斯亚硝酸盐试剂、0.04%酚红、Ehrlish试剂、二甲苯、DL-苯丙氨酸、10%氯化铁、磷酸二氢铵、柠檬酸钠、磷酸二氢钠、0.1%酪氨酸、台盼蓝、琼脂粉、酵母粉、酵母膏、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、浓盐酸、可溶性淀粉，均为国产;牛肉浸粉、牛肉膏、蛋白胨，均购自Sigma公司。

2?方法

2.1?细菌的分离处理

2.1.1?制样品稀释液

取样品土壤500g置于80℃烘箱中烘烤24h，过筛，称取150g土壤放入烧杯中，加水至350mL，煮沸15min，过滤，取滤液，制成1∶10浓度的悬液。另取装有无菌水的试管6支，编号10-1、10-2、10-3、10-4，10-5、10-6进行梯度稀释，移取500μL 10-1管中土壤悬液于10-2管中混匀，然后移取500 μL 10-2管中土壤悬液于10-3管中混匀，直至稀释到10-6管，另取500μL 10-6管中液体弃去。

2.1.2?培养

从10-4、10-5、10-6管的稀释液中取150μL滴加到台盼蓝选择培养基平板上，用涂布棒均匀涂布，并将培养基倒置培养于37℃恒温箱中，培养24h。

2.1.3?分离单菌落

挑取有透明圈的单菌落，接种于灭菌的LB液体培养基中，置于37℃，180rpm摇床中培养6h。

2.1.4?纯化

采用平板涂布法，用微量移液器分别移取20μL、50μL、100μL、150μL、200μL均匀涂布于LB固体培养基上，37℃恒温培养24h，并重复此步骤多次达到纯化。

2.2?生物学特性研究

2.2.1?菌落培养特征

在台盼蓝选择培养基上进行培养，观察并记录。

2.2.2?菌体形态观察

挑取培养的单菌落，进行革兰染色与孔雀石绿染色，镜检，观察形态。

2.2.3?革兰染色[7]

用接种环挑取LB平板上生长的单菌落，在滴有蒸馏水的载玻片上均匀涂开，将涂好的玻片用酒精灯火焰固定，在涂片处用结晶紫染色液处理1min，用水冲洗干净;碘液处理1min，用水冲洗干净;95%的乙醇脱色处理30s，用水冲洗干净;沙黄复染15s，用水冲净，烘干，油镜下观察。

2.2.4?孔雀石绿染色[8]

切片用饱和的孔雀石绿水溶液染10min，蒸馏水冲洗;0.5%番红复染30s;水洗，吸干;镜检，芽孢呈绿色，菌体和芽孢囊呈微红色。

2.2.5?血平板试验

采用新疆多浪绵羊血制作血平板，将菌株接种于血平板上，观察溶血现象。

2.3?細菌的生化鉴定

地衣芽孢杆菌鉴定参考《常见细菌系统鉴定手册》[9]及《伯杰细菌鉴定手册》[10]的方法，对分离的细菌进行鉴定。

2.3.1?柠檬酸盐利用试验

无菌条件下，将单菌落接种于柠檬酸盐培养基中，37℃恒温培养3～7d，观察颜色变化。

2.3.2?丙酸盐利用试验

将菌种划线接种于丙酸盐培养基上，37℃恒温培养，连续3代移种，观察颜色变化。

2.3.3?淀粉水解试验

用接种环取菌种涂布在培养基表面，37℃恒温培养24～48h，取出后滴加碘液，观察菌落周围变化。

2.3.4?卵黄卵磷脂酶试验

接种环取少量幼龄菌种（培养18～24h）涂布于卵黄卵磷脂酶平板上，37℃恒温培养24～48h，观察菌落四周是否出现不透明区。

2.3.5?硝酸盐还原试验

取纯培养物接种于硝酸盐培养基中，37℃培养18～24h，加入试剂3～5滴，30s内出现红色为阳性。

2.3.6?吲哚试验

将菌种接种于蛋白胨水培养基中，37℃恒温培养24h后，取出加入2mL二甲苯，摇匀静置，沿试管壁缓慢加入Ehrlish试剂2mL，静置，观察颜色变化。

2.4?地衣芽孢杆菌16S rDNA的鉴定

2.4.1?基因组DNA的提取

细菌DNA提取方法按照北京全式金生物技术有限公司DNA提取试剂盒（M10208）说明书进行操作。

2.4.2?16S rDNA基因扩增

选择通用引物扩增芽孢杆菌16S rDNA的全长序列。细菌通用引物序列为27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3′，进行PCR扩增。PCR扩增体系：DNA模板1μL;上游引物和下游引物各1μL;EasyTaq Super Mix 25μL，加入ddH2O补至50μL。PCR扩增程序：94℃预变性5min;94℃变性30s，55℃退火30s;72℃延伸90s;35个循环;72℃再延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳。

2.4.3?纯化和测序

PCR产物经纯化后与pMD19-T载体连接，送由北京天一辉远有限公司测序，将测定的序列通过NCBI/BLAST工具进行序列比对，确定其具体的菌属。

3?结果与分析

3.1?细菌的培养

对菌液用无菌水分别进行6个梯度稀释，置于台盼蓝筛选平板上。结果表明，随着稀释倍数的增大平板上生长的菌落数减少，逐渐出现单菌落。

3.2?细菌形态

挑取白色透明圈的单菌落，进行革兰染色，镜检结果见图1，待检菌革兰染色呈阳性，菌体呈直杆状，两端钝圆。孔雀石绿染色镜检结果见图2。

3.3?菌落形态及血平板毒力测试

将该菌接种于LB固体培养基上，观察菌落呈圆形、扁平、表面粗糙，边缘不整齐，灰白不透明，培养24h后菌落趋于相互融合，菌苔表面出现山丘状和裂叶状（见图3）;将该菌划线接种于血平板上，培养24h后，未出现溶血环，观察落菌形态边缘光滑，不规则，表面湿润，无透明或不透明的灰白色小菌落（见图4）。

3.4?生理生化实验鉴定结果

3.4.1?丙酸盐利用、柠檬酸盐利用实验结果

在丙酸盐利用试验中，将菌种划线接种于丙酸盐培养基上，培养基变蓝，实验结果为阳性;在柠檬酸盐的利用试验中，适温培养4d后，培养基对光旋转呈蓝色，实验结果为阳性。

3.4.2?淀粉、卵黄卵磷脂、硝酸盐还原试验结果

将该菌接种于淀粉培养基培养24h后，滴加碘液，菌落周围出现不变色透明圈，淀粉水解呈阳性;将该菌接种到卵黄卵磷脂培养基培养24h后，观察菌落四周有浑浊环出现，表示卵磷脂分解成脂肪，说明分离纯化的菌株中含有卵磷脂酶;将该菌接种到硝酸盐还原为亚硝酸盐培养基24h后，滴加试剂，30s内出现红色，表明该菌能将硝酸盐还原;将该菌接种到吲哚培养基中恒温培养24h后，取出加入二甲苯和Ehrlish试剂，培养基不变色，实验结果为阴性。

3.4.3?生化试验鉴定结果

淀粉水解试验、丙酸盐利用试验、卵黄卵磷脂酶试验、硝酸盐还原试验、吲哚试验、柠檬酸盐利用试验等生物化学试验鉴定结果见表1。

3.5?16S rDNA的鉴定结果

3.5.1 16S rDNA的扩增结果

由图5可以看出，成功扩增了该菌的16S rDNA的基因序列。

3.5.2?16S rDNA克隆鉴定结果

该细菌16S rDNA的基因序列与pMD19-T连接后转化DH5α，提取质粒送测序，阳性克隆鉴定如图6。

3.5.3?16S rDNA的序列进化树同源性分析结果

将测序所得序列去掉相关的载体序列后，得到该菌的全长16S rDNA序列信息。该菌株的16S rDNA长度为1500bp，将其结果提交到NCBI数据库进行核酸比对后，建立进化树。分析表明，该菌株与登录号为KU986668、CP025226、MK063874、MN493780、MG97702的地衣芽孢杆菌处于同一分支，且根据同源性分析，该菌株与登录号为KU986668、CP025226、MK063874、MN493780、MG97702的地衣芽孢杆菌同源性为100%，进化树分析结果见图7，同源性比较见表2。根据上述结果，可以确定该菌株为地衣芽孢杆菌。

4?结论与讨论

面对土壤中庞大的微生物群体，通过对一份土壤进行高温烘烤处理，培养获得单菌落，取该菌落在台盼蓝平板上培养，反复纯化，最终挑选长出白色透明圈的菌落作为实验出发用菌，进行革兰染色和孔雀石绿染色镜检后，观察细菌形态呈杆状，两端钝圆，芽孢中生，孢囊稍膨大，确定分离得到1株芽孢杆菌。通过参考《常见细菌系统鉴定手册》及《伯杰细菌鉴定手册》，又结合地衣芽孢杆菌所特有的能够利用丙酸盐的特性，初步鉴定为地衣芽孢杆菌。

同时，对该菌进行柠檬酸盐利用试验、淀粉水解试验、明胶液化试验、硝酸盐还原试验等一系列的生化鉴定试验。试验结果表明，该菌具备地衣芽孢杆菌的不可形成吲哚、不可水解酪氨酸、不具有苯丙氨酸脱氢酶的生化特征，由此可以初步断定该菌为地衣芽孢杆菌。最终通过对该菌进行DNA提取、PCR扩增、纯化及测序，将其16S rDNA基因序列信息进行建立进化树及同源性分析，进一步确定该菌为地衣芽孢杆菌。

地衣芽孢杆菌在较高温度下仍能生长繁殖，并且能够产生淀粉酶和蛋白酶，对有些有害菌如葡萄球菌、白色念珠菌具有明显的抑制作用。然而，近年来对地衣芽孢杆菌的研究进展仍报道得比较少，虽已证实其拥有良好的使用效果，但具体作用机理机制尚不明确，且其研究主要集中在抗菌特性方面，未来可利用基因工程将该菌的优良特性与其它菌结合，构建和表达出一种更优良的基因，并将其应用到更加廣泛的领域中。试验结果进一步丰富了我国地衣芽孢杆菌的研究进展，为地衣芽孢杆菌的进一步研究及应用奠定基础。

参考文献

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[4]?Kim Y，Cho J Y，Ku K J H，et al. Identification and antimicrobial activity of phenylacetic acid produced by Bacillus Licheniformis isolated from fermented Soybean， Chnngkook-Jang[J]. Current Microbiology， 2004， 48 （4）： 312-317.

[5]?Mandal M D，Mandal S，Pal N K.Plasmid-mediated dimethoate degradation by Bacillus Licheniformis isolated from a fresh water fish Labeo rohita[J]. BioMed Research International， 2005， 25 （3）： 280-286.

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[7]?黄荔丰.微课“革兰染色”的教学设计[J].课程教育研究，2017（41）：19.

[8]?樊佳，韩煦，陶榆玮，等.芽孢染色实验中枯草杆菌最佳培养条件探索[J].实验技术与管理，2018，35（03）：58-61.

[9]?东秀珠，蔡妙英.常见细菌鉴定手册[M].北京：北京科学教育出版社，2001.

[10]?伯杰细菌鉴定手册[M].第九版.科学出版社，1994.

（责任编辑?周康）

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