| 标题 | 植物抗寒性基因研究综述 |
| 范文 | 王庆杰 王立 [摘 要]综述了在低温胁迫下，植物不饱和酶基因，脯氨酸和甜菜碱的调节及其基因表达，Ca2+及钙依赖的蛋白激酶对植物抗寒性反应中的调节，抗氧化酶，植物冷诱导基因，植物抗冻蛋白基因工程的研究进展。 [關键词]植物；抗寒基因；表达 [中图分类号]Q945.78 [文献标识码]A 在低温胁迫下，植株的细胞结构会受到伤害，而且会引发物质代谢紊乱，甚至引起死亡，在农业以及林业生产中造成重大的损失。据统计，世界每年因植物冻害造成的损失达2000亿美元左右。随着分子生物学的发展，导入外源基因已经成为提高植物抗逆性的主要手段。因此，对植物抗逆性基因的研究，无论在理论上还是实际生产中，都有广泛的应用价值。本文综述了近年来抗寒性基因工程的研究进展。 1 植物不饱和脂肪酸酶及基因 Levitt，Paha等以及Orvat指出，冷害首先发生在细胞膜和与细胞膜相关的过程。在冷胁迫下，植物的膜系统会发生相变，膜脂从液晶相变为凝胶相，使膜发生收缩，使镶嵌于膜上的膜蛋白（酶）被固定，酶系统遭受到破坏，膜上出现孔道或龟裂，细胞膜的主动运输和选择透过的特性丧失，膜透性增大，因此使膜内可溶性物质、电解质大量向膜外渗透，破坏了细胞内外的离子平衡。膜系统的稳定性直接影响光合和呼吸作用的活性。因此，低温首先引起膜系统的透性和活性的变化，从而使光合作用减弱，体内的保护系统受到破坏，呼吸速率大起大落，同时细胞间冰晶对细胞膜和细胞壁产生机械损伤，水分平衡受到破坏，最终导致植物死亡。 影响植物膜质脂肪酸饱和性的酶主要有两类，一类是膜质脱饱和酶，另一类是脂酰转移酶。 在低温下，膜质脱饱和酶可以被诱导表达，从而提高植物在低温下的不饱和度，增加膜系统的稳定性。在已研究的膜脂脱饱和酶基因中fad4、fad5、fad6、fad7、fad8、desC和des9有控制叶绿体中脂肪酸的脱饱和作用；fad2和fad3控制内质网的脂肪酸脱饱和作用。desC基因编码△9酯酰脱饱和酶，催化已经酰化到甘油C-1位置的硬脂酸在9号碳的位置形成第1个双键。转化大肠杆菌和烟草试验表明，desC基因转化可提高转化体的不饱和度，增强抗寒性。fad3、fad8、fad7编码的蛋白为w-3脂肪酸脱饱和酶，他们催化亚油酸脱饱和作用，形成a-亚油酸，转化w-3脂肪酸脱饱和酶可以提高转化植株三不饱和脂肪酸含量，提高了植物的抗寒性。 2 脯氨酸和甜菜碱的调节作用及其基因表达 大量的研究揭示，在低温胁迫下，植物细胞会出现水分亏缺和渗透胁迫，作为渗透调节剂和渗透保护剂的脯氨酸、甜菜碱及糖醇等相容性溶质的积累，是植物响应低温胁迫的一个重要机制。其中，脯氨酸和甜菜碱是分布最普遍和效应最广泛的两种。 几乎所有的高等植物，在低温胁迫下，都会发生脯氨酸的大量积累。只是不同的种类和品种间有差异，有的增加几倍，有的增加几十倍、上百倍不等。研究表明，随着脯氨酸的含量的增加，植物的抗逆性也增加。总之，细胞内脯氨酸积累与植物体抗逆性的增强的密切关系，已为许许多多的研究结果所确实。 研究表明，抗冻性极强的高山雪莲在人工控制的2℃ 低温锻炼过程中，脯氨酸合成酶基因的表达水平也提高，导致脯氨酸的积累增加，幼苗的抗冻性也增加。番茄培养细胞在水分缺亏条件下迅速积累脯氨酸水平比对照正常条件下高300倍。 甜菜碱也是一种极好的相容性溶质。它有很多种类型，甘氨酸甜菜碱（glycine betaine，GB）是其中的一种代表型。甜菜碱的积累可显著提高植物的抗寒性，如将COD基因转入拟南芥，使其中的甜菜碱高积累达到1.2umol/gFW以上，可提高拟南芥的抗寒性。将BADH基因转入烟草、小麦和草莓中，实验表明转基因植物的BADH增高，其抗寒性和抗盐性均增强。 有研究指出，当大麦幼苗水分亏缺或盐胁迫时，甜菜碱和脯氨酸同时以相似的速度在叶片积累，但当胁迫解除后，二者的降解速度却十分不同，叶片和根中脯氨酸含量迅速下降，而甜菜碱的含量保持基本稳定。这说明，脯氨酸的积累是植物对胁迫的暂时性反应，而甜菜碱的积累则是有一定时间的持久性。甜菜碱代谢缓慢的特点，表明代谢主要是由其合成酶所调控，而脯氨酸的迅速代谢则是受其合成酶和降解酶两个方面调节，在胁迫时，降解酶被抑制；当胁迫解除，降解酶立即活化，因而含量迅速减少。 3 植物冷诱导基因及转录因子CBF 植物冷诱导基因是种诱发基因，只有在一定的条件下，才能被诱发表达（主要为低温和短日照）。有些基因专一性地受低温诱导表达，可称之低温专一诱导基因； 而有些基因不仅受低温诱导，还能被ABA、短日照、水分胁迫等诱导，这样的诱导基因又可称为冷调节基因。 在最近的几十年中，已经有很多经过低温胁迫的诱导表达的抗寒性基因从植物体内分离得到。如拟南芥中，冷诱导基因-Cor基因，又称为Lti或rd或Kin基因，研究较多的是Cor15、Cor6.6和Cor78；油菜的BN28和BN15，这两个冷诱导基因分别与拟南芥的Cor6.6和Cor15同源，苜蓿的cas18和cas15基因，菠菜的cap基因，马铃薯的PA13基因，小麦的Cor39、WCS120和WCS200基因等。 在拟南芥对低温和干旱胁迫反应的启动子分析中，Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki（1994）证实，冷调节原件是一种保守序列9bpTACCGACAT组成，其核心序列为5bpCCGAC，也称C-repeat/TRE，这个调节原件可对低温响应。该序列在其他抗寒基因的序列中也发现了，包括拟南芥的COR15a，油菜的BNII5，小麦的WCSI20。要研究调控的分子机理必须分离出编码C-repeat结合蛋白的cDNA—CBF1。CBF1可结合到CRT/DRE的DNA调控基序上，它的分子质量为24kDa，含有一个AP2区域，其中有一个DNA结合区段。就目前已知的CBF家族中包括有CBF1，CBF2，CBF3，CBF4。由于CBF1-3基因除了具有抗寒作用外，还有抗旱性。所以它们又被分别称为DREB1b，DREB1c，DREB1a。 CBF/DREB1基因能在冷胁迫下迅速且瞬间表达，它的产物可以激活它下游的各种胁迫反应的靶基因表达。所有的Cor基因的启动子都带有CRT/RDE调节元件，可与转录活化因子CBF-结合，可刺激Cor基因的表达。Jaglo-Ottosen等（1998）培育出能够超表达CBF1的拟南芥，使得整套的Cor基因（Cor6，Cor15a，Cor47，Cor78，KN1，ERD10等）在没有低温诱导下也能表达。他们通过细胞膜电解质渗透实验测定，发现超表达CBF1的植株抗寒性比只表达Cor15a植株的抗寒性高3.3℃；CBF1的超表达还能提高植株的冰冻存活率，而只表达Cor15a植株则不能。有研究表明，Cor15a基因表达产物15kDa多肽在输入叶绿体基质片层中后，被加工成9.8kDa的成熟多肽。在转基因的拟南芥植株中，Cor15a的表达，可以增强叶绿体的抗寒性，从-4～-8℃增加到-6～-10℃。 4 Ca2+及钙依赖的蛋白激酶对植物抗寒性反应中的调节 大量的研究表明，Ca2+是低温下参与信号转导途径的第二信使，参与信号的传递。在低温胁迫下，细胞内的Ca2+水平增加。Ca2+可和CaM结合形成Ca2+-CaM复合物，使CaM活化，介导细胞内各种依赖Ca2+的生理生化过程。Ca2+-CaM可直接作用于效应系统，如激活质膜和液泡膜上的Ca2+-ATPase，使增加的Ca2+撤退。另一方面，Ca2+-CaM可磷酸化级联反应将信号传递各下游胁迫响应基因，调控这些基因的表达和产物的活化，使植株的抗寒性增加。 在由低温引起的Ca2+流入和抗冻基因的表达中，植物钙依赖的蛋白激酶（caIciurn dependent protein kinases，cDPKs）的转录水平增高，cDPKs的激酶活性被进一步激活。 Ray等的研究发现，在低温、干旱、盐胁迫条件下，水稻中31个CDPKs基因中有6个基因受胁迫诱导表达量上升，1个基因受胁迫刺激表达量下降。Wan等对11个水稻CDPKs基因在干旱、低温、高盐和稻瘟病菌浸染等胁迫和激发子处理条件下的转录表达分析表明，每个基因至少受2种胁迫诱导而产生2倍以上水平的表达变化。在正常环境条件下，水稻OsCDPKs7基因转录水平很低，在10d龄的水稻小苗中检测不到mRNA的积累，但当经过盐胁迫或低温处理8～24h后，OsCDPK7基因mRNA表达量大量增加。OsCDPK13基因受低温诱导表达上升，并且在耐低温品种中的表达量高于在低温敏感品种中的表达量。OsCDPK7基因表达量越高转基因水稻对胁迫的耐性就越强。同时，OsCDPK7基因的超表达增强了salT、rabl6A等胁迫响应基因在盐胁迫条件下的诱导。这表明OsCDK7基因可能就是调控salT、rabl6A 等下游胁迫响应基因来参与水稻对盐胁迫的耐性反应。但在低温胁迫下不能诱导这些基因的表达。这些结果表明OsCDPK7基因同时参与了水稻低温和盐胁迫反应的信号转导，但水稻对低温胁迫与盐胁迫的响应是两条不同的信号途径。 在低温下，Ca2+的增加还可促进脯氨酸的积累，这一现象已在Amarathus和番茄幼苗及培养细胞实验中证实。Ca2+还可调节冷诱导基因的表达。可见，Ca2+ 在植物细胞对低温反应中起着一个中心的关键性调节作用，对植物的抗寒性有着极其重要的作用。 5 抗氧化酶基因 活性氧（reactive oxyen species，ROS）是生物体有氧代谢产生的一类活性含氧化合物总称，包括有超氧阴离子（O2-），过氧化氢（H2O2），羟自由基（.OH），单线态氧（1O2）等。高浓度的活性氧几乎能与所有细胞成分发生反应：破坏蛋白质结构，嘌呤氧化，并引起脂质的过氧化，导致膜结构破坏。 许多研究表明，外界环境的胁迫，包括低温、干旱、盐碱等非生物胁迫会导致ROS的发生和抗氧化系统间的动态平衡的破环。在这些逆境中，如寒冻胁迫过程中，自由基将会积累，从而造成植物细胞脂质过氧化，从而引发一系列的植物细胞的损伤。植物的抗氧化系统能够稳定膜结构，调节膜透性。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）等，这些物质协同作用以去除植物体内的活性氧自由基，尤其以SOD最为重要，它是植物体内清除活性氧的关键抗氧化酶。 Gupta等将外源Cu/Zn-SOD基因导入烟草中，转化株的叶绿体中SOD 超表达，SOD酶的活性升高，同时清除APX 活性也升高，从而增加了烟草抵抗低温引起发光抑制的能力。 6 植物抗冻性蛋白（植物AFP） AFP是一种适应低温的特异蛋白质，它能阻止体液内冰核的形成与生长，维持体液的非冰冻状态。了解其特征和抗冻生理机制对农作物抗冻品种选育有重要意义。 AFP是一种低温诱导蛋白，胡萝卜的AFP基因在非冷驯化状态下不表达，而在冷驯化状态下表达水平迅速呈特异性地提高。转基因植物的AFPs通常只在低温（4℃）诱导下才能检测到其表达。更值得一提的是，AFPs有亲水性和热稳定性，这也与冷诱导蛋白相似。 Griffith等第一次明确提出获得了植物内源AFPs，他们从经过低温锻炼的可以忍受胞外结冰的冬黑麦叶片质外体中得到并部分纯化了抗凍蛋白。同年，美国圣母大学的Duman实验室在多种植物中发现了具有热滞效应的蛋白质。1994年我国学者费云标等从常绿抗冻植物沙冬青（Ammop ip tanthus monglicus） 叶片中分离得到了抗冻蛋白的蛋白质。 AFP不仅存在于被子植物中，且裸子植物、蕨类植物及苔藓植物中均发现有抗冻活性的特异蛋白质。另外低等植物包括真菌和细菌中也存在AFP。已研究的绝大多数植物材料中AFP活性大大低于鱼类和昆虫，所研究的植物虽多达几十种，但真正被分离纯化出来的AFPs尚不多，据报道冬季常绿乔木北海道黄杨能忍耐-23.9℃低温，若能从其中提取出抗寒基因并转入其他植物，无疑将极大地提高转基因植株抗寒性，因为植物内源AFPs基因更适合在植物体内表达。因此如何从植物中分离出更多的、活性更高的AFP，并通过遗传转化将其导人抗寒性弱或不抗寒植物中进而获得抗寒性强的转基因植株，将是今后植物抗寒性基因工程研究的主要内容之一。 若能够很好地将植物抗寒性基因的研究應用于寒冷地区林业植物以及农业植物的栽培当中，我们将会在林业栽培以及农作物种植方面取得极大的进展。 [参考文献] [1] Levitt J. 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