《绿绒蒿SSR-PCR反应体系的建立与优化》-农学论文，农业论文-论文范文参考-科学狗论文网

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绿绒蒿SSR-PCR反应体系的建立与优化

范文

熊健　屈燕　冷秋思　赵琬玥

摘要：为建立适合绿绒蒿属（Meconopsis Vig.）的SSR反应体系，以多刺绿绒蒿（M. horridula）为试材，应用L25（56）进行正交试验，对影响SSR-PCR的主要因素进行优化。结果发现，Mg2+对PCR反应效果影响最大，而dNTPs的影响最小。5个因素水平的变化对绿绒蒿属SSR-PCR反应体系的影响从大到小依次为Mg2+>Taq酶含量>引物浓度>DNA模板量>dNTPs浓度。适宜绿绒蒿属的SSR反应体系：总体积25 μL，Mg2+浓度2 mmol/L，dNTPs浓度 0.2 mmol/L，引物浓度 0.5 μmol/L，DNA模板量60 ng，Taq聚合酶量 1.6 U，其余用ddH2O补充。扩增程序为94 ℃ 1.5 min;94 ℃ 20 s，最适退火温度20 s，72 ℃ 1 min，共35个循环;72 ℃ ?5 min;4 ℃ 保存。利用优化后的反应体系对同属另外8种绿绒蒿（M. wallichi、M. racemosa、M. lingholm、M. prattii、M. rudis、M. napaulensis Pinky、M. paniculata、M. superba）進行PCR扩增，均获得优良的扩增产物。因此，该试验建立的反应体系适用于绿绒蒿属植物的 SSR-PCR 反应。

关键词：绿绒蒿;SSR;PCR体系优化

中图分类号： Q949.95文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）08-0060-04

绿绒蒿是罂粟科（Papaveraceae）绿绒蒿属（Meconopsis）植物的总称，有“高山牡丹”之称。绿绒蒿是一年或多年生草本，花大而美丽，颜色丰富，有蓝色、紫色、红色、黄色，稀白色。全世界共有49种，1种产自西欧，其余48种均分布于东亚的喜马拉雅地区，但最原始种恰在华中[1]。我国有38种，集中分布于西南部。绿绒蒿不仅花色艳丽，具有很高的观赏价值，是著名的观赏植物，同时还是传统藏医药用植物，有清热解毒、利尿、消炎、止痛等功效[2]。作为潜力巨大的药用观赏植物，目前绿绒蒿属大多数物种已处于濒危状态。

简单重复序列（simple sequence repeats，简称SSR）又称微卫星DNA，是以1～6个碱基为基本单元的串联重复序列。SSR分子标记具有多态性丰富、高信息量、共显性、检测方便等优点。SSR分子标记是目前最为常用的微卫星标记之一[3]。目前，在国内尚未有关于绿绒蒿属植物SSR-PCR反应体系的研究成果。本研究以多刺绿绒蒿为试材，通过正交设计试验对SSR-PCR反应体系中的Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、DNA模板量、Taq聚合酶量等5个主要因素进行探索优化，筛选出各因素的最适量，建立和优化绿绒蒿 SSR-PCR 的反应体系，为绿绒蒿属的遗传多样性研究提供技术支持和参考[4]。

1材料与方法

所有试验均于2017年12月20日至25日在西南林业大学园林学院实验室完成。

1.1材料

试验以多刺绿绒蒿（M. horridula）为试材及SSR引物P23进行反应体系的正交设计试验，建立和优化反应体系，并选取M. wallichi、M. racemosa、M. lingholm、M. prattii、M. rudis、M. napaulensis Pinky、M. paniculata、M. superba等8种绿绒蒿DNA以及SSR引物P2、P10、P29进行反应体系的验证。试验中所用到的SSR引物由笔者所在课题组通过转录组数据开发，并由昆明硕擎生物科技有限公司合成。引物序列见表1。

1.2生物试剂

SSR-PCR反应体系中的10×PCR Buffer（含Mg2+）、dNTPs、Taq聚合酶、DNA maker、Loading Buffer购自绿诚生物技术有限公司。

1.3基因组DNA的提取与检测

利用试剂盒法提取9种样品（表2）试验所需绿绒蒿DNA，通过微量分光光度计测定DNA的纯度和纯度，筛选出D260 nm/D280 nm值在1.8～2.0之间的优质DNA，然后利用1%琼脂糖凝胶电泳对DNA质量进行检测，选出各样品中质量最佳的[JP3]DNA各1份，稀释至20 ng/μL，置于-70 ℃保存备用（图1）。

1.4SSR-PCR反应体系的正交试验设计

以M. horridula为试材，利用引物P23进行正交试验。优化SSR-PCR的正交试验以L25（56）正交表进行设计，以5因素（Mg2+、dNTPs、引物浓度、DNA模板量、Taq聚合酶量）的5个水平进行正交试验，共25个组合（表3）。PCR扩增体系为 25 μL体系，除了添加表3内的各种反应液外，需添加ddH2O进行补充。试验进行2次重复。

1.5PCR扩增与检测

PCR反应在BIOMETRA TProfessional standard梯度PCR仪上进行。反应体系为25 μL体系。反应组合共25个，在退火温度设置为60 ℃下进行1次PCR扩增并进行琼脂糖凝胶电泳检测，PCR反应程序见表4。

扩增产物取2 μL加入4 μL Loading Buffer，通过1%琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶通过BioSpectvum AC Chemi HR 410凝胶成像仪进行成像观察并保存胶图。

1.6统计与数据分析

参照何正文等的方法[5]，根据扩增条带的清晰度、弥散程度以及特异性对每个条带进行独立评分，最高记10分（条带清晰，弥散程度弱，特异性高），最低记1分。利用SPSS 17.0软件对2次重复试验的评分值总数进行方差分析。

1.7最佳SSR-PCR反应体系的验证

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