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标题

辣木果腐病病原菌兰生炭疽菌(Colletotrichum chlorophyti)生物学特性及其防治药剂室内毒力测定

范文

刘一贤蔡志英施玉萍戴利铭李岚岚杨焱龙继明李海泉张祖兵

摘要：辣木果腐病作为辣木上的重要病害，已严重影响辣木籽产量。为了进一步明确辣木果腐病病原菌兰生炭疽菌（Colletotrichum chlorophyti）的生物学特性，筛选出具有较好防效的药剂，采用单因子变量试验，研究不同培养基、碳源、氮源、温度、pH值、光照条件、致死温度对菌丝生长的影响，并对10种常用杀菌剂进行室内毒力测定。结果表明，V-8汁、YEPD、PDA培养基有利于病原菌生长，适宜温度范围为28～30 ℃，最适温度为30 ℃，最适合生长pH值为7～9，致死温度为50 ℃处理10 min。该病原菌能有效利用多种碳源和氮源，碳源以可溶性淀粉利用率最高，氮源以酵母浸膏利用率最高。不同的光照条件对菌丝生长有影响，在24 h黑暗条件下更有利于菌丝生长。在供试的10种杀菌剂中，450 g/L 咪鲜胺水乳剂和250 g/L嘧菌酯悬浮剂对病原菌的抑菌效果最好，EC50分别为0.050 5、0.063 5 mg/L;其次，250 g/L丙环唑乳油、70%甲基硫菌灵可湿性粉剂、10%苯醚甲环唑水分散粒剂、50%多菌灵可湿性粉剂对病原菌也具有较好的抑制作用，EC50均小于1.0 mg/L;50%异菌脲可湿性粉剂对病菌的抑菌效果最差，EC50为52.698 7 mg/L。

关键词：辣木;果腐病;兰生炭疽菌;生物学特性;毒力测定;病原菌菌丝生长;致死温度;杀菌剂

中图分类号： S435.79?文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）20-0133-05

辣木（Moringa spp.）又称鼓槌树、奇迹树，是一种多年生速生小乔木，树龄约20年[1]。早在19世纪辣木就从印度传到了我国。台湾是我国最早引种辣木的地区，2006年种植面积已达3 000 hm2[2]。辣木具有极高的营养价值，含有丰富的氨基酸、蛋白质、维生素、油脂和矿物质，应用价值比较广泛。辣木种植区域主要分布在云南、海南、广东、四川、福建和贵州等地，且60%以上的面积分布在云南[3]，在西双版纳、普洱、德宏、丽江等地规划辣木种植面积超过百万亩[4]。随着种植规模的不断扩大，辣木病虫害的发生严重威胁辣木产业的健康发展。目前，辣木上报道的主要病害有果腐病、幼苗萎蔫病、枝枯病、白粉病等[5-9]。

辣木果腐病严重危害果荚，在雨水密集的月份引起大量果荚感病腐烂，种子减产，已成为辣木上的重要病害。该病初期表现为在果荚上形成淡褐色、棕褐色的块状、条状或不规则病斑，高温、高湿条件下，病斑迅速向四周扩张，果荚上的块状病斑连接起来导致果荚棕褐色坏死，切开感病部位，受害部果肉为污褐色坏死，病健交界明显，严重时整条果荚裂开，露出种仁[10]。引起辣木果腐病的病原较为复杂，可能由多种病原菌复合侵染造成。印度学者报道了由夏威夷内脐蠕孢（Drechslera hawaiiensis）侵染引起辣木果腐[11];蒋桂芝等报道了由半裸镰刀菌（Fusarium semitectum Berk & Rav.）引起辣木果荚腐病[12];He等在西双版纳景洪采集到的病样中分离到瓜筓霉（Choanephora cucurbitarum）[13]。笔者所在项目组通过对西双版纳辣木种植区进行果腐病调查，对病样进行分离鉴定、柯赫氏验证、致病性测定，将病原菌确定为兰生炭疽菌（Colletotrichum chlorophyti）[10]，该病原菌不仅能侵染果荚，还能侵染叶片引起叶斑[14]。为了有效控制该病地传播和蔓延，了解病原菌的生物学特性，对掌握该病害的发生规律必不可少。在无优良的抗病品种、改良栽培措施也无法有效控制该病害的情况下，化学防治也不失为行之有效的办法。但目前尚无辣木果腐病防治药剂的研究报道，咪鲜胺和苯醚甲环唑对柑橘炭疽病的防效明显高于其他药剂[15]，25%丙环唑乳油1 000倍液对蓝莓炭疽病具有较好的防治效果[16]。吡唑醚菌酯和甲基硫菌灵的不同配比对辣椒炭疽病的防效在80%以上[17]。咪鲜胺、多菌灵和甲基托布津对橡胶树胶孢炭疽病菌和尖孢炭疽菌较为敏感[18]。本研究首先通过对兰生炭疽菌进行生物学特性研究，分析不同温度、光照、pH值、碳氮源等条件下对菌丝生长的影响，在此基础上采用生长速率法，比较10种杀菌剂对病原菌的毒力，初步筛选出辣木果腐病菌的防治药剂，为田间防治该病提供理论依据。

1?材料与方法

1.1?试验材料

试验于2017年8—12月在云南省热带作物科学研究所植物保护与微生物利用研究中心进行。供试菌株辣木果腐病病原菌兰生炭疽菌（Colletotrichum chlorophyti S. Chandra & Tandon）由笔者所在课题组分离鉴定保存。

培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基，葡萄糖20 g、马铃薯200 g、琼脂20 g，补水至1 000 mL;V-8汁培养基，市售V-8汁200 mL、CaCO3 3 g、琼脂20 g，加蒸馏水至 1 000 mL;PCA培养基，胡萝卜200 g、马铃薯200 g、琼脂 18 g，加蒸馏水至1 000 mL;查彼（Czapek）培养基，K2HPO4 1 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、NaNO3 0.5 g、蔗糖25 g、琼脂20 g，加蒸馏水至1 000 mL;酵母膏胨葡萄糖琼脂（YEPD）培养基，酵母膏10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g，加蒸馏水至1 000 mL，pH值6.0;合成低营养琼脂（SNA）培养基，KH2PO4 1.0 g，KNO3 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，葡萄糖0.2 g，蔗糖0.2 g，瓊脂15 g，加蒸馏水至1 000 mL;燕麦片琼脂（OA）培养基，燕麦片30 g、琼脂20 g，加蒸馏水至1 000 mL。

供试杀菌剂名称及厂家见表1。试剂均为国产分析纯;CLIMACELL恒温恒湿培养箱，购自明尼苏达矿务及制造业公司。

1.2?试验方法

1.2.1?辣木果腐病病原菌的生物學特性

培养基：病原菌活化5 d后从菌落边缘打取菌饼，接种于V-8汁、PCA、Czapek、YEPD、SNA、OA、PDA 7种不同的培养基上，每处理设3次重复，28 ℃暗培养，6 d后用“十”字交叉法测量菌落直径，观察菌落特征。

温度：病原菌活化5 d后从菌落边缘打取菌饼，接种于PDA培养基上，设置培养箱温度分别为5、10、15、20、25、28、30、35 ℃，将病原菌置于不同温度培养箱中培养，每处理设3次重复，培养6 d后用“十”字交叉法测量菌落直径。

pH值[19]：用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH溶液调节PDA培养基的pH值分别为3、4、5、6、7、8、9、10、11，制成不同pH值的PDA平板。用直径为5 mm的打孔器，在活化5 d后的菌落边缘打取菌饼，接种在不同pH值的PDA平板上，每处理重复3次，28 ℃暗培养，6 d后用“十”字交叉法测量菌落直径。

碳源：用麦芽糖、葡萄糖、乳糖、果糖、半乳糖、可溶性淀粉、山梨醇、木糖、甘露醇、鼠李糖、甘油11种碳源等量代替Czapek培养基中的蔗糖，制成不同碳源的培养基。用直径为5 mm的打孔器，在活化5 d后的菌落边缘打取菌饼，将病原菌接种在不同碳源的Czapek平板上，每处理重复3次，28 ℃暗培养，6 d后采用“十”字交叉法测量菌落直径。

氮源：用L-天冬酰胺、酪氨酸、甘氨酸、牛肉浸膏、尿素、L-丙氨酸、NaNO2、NH4Cl、胱氨酸、色氨酸、胱氨酸、L-精氨酸、酵母浸膏、（NH4）2SO4 14种氮源等量代替Czapek培养基中的NaNO3制成不同氮源培养基。用直径为5 mm的打孔器，在活化5 d后的菌落边缘打取菌饼，将病原菌接种在不同氮源的Czapek平板上，每处理重复3次，28 ℃培养箱中暗培养，6 d后用“十”字交叉法测量菌落直径。

光照条件：设置24 h黑暗、24 h光照、12 h黑暗/12 h光照3种光照条件。用直径为5 mm的打孔器，在活化5 d后的菌落边缘打取菌饼，将病原菌接种在的PDA平板上，置于不同光照条件下28 ℃培养，每处理重复3次，6 d后用“十”字交叉法测量菌落直径。

致死温度[20]：在无菌条件下，将病原菌的菌饼分别放入已灭菌的小试管中，加入2 mL无菌水，在预设温度为40、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、60 ℃恒温水浴中处理 10 min，每处理重复3次。然后将菌块取出移至PDA培养基中28 ℃条件下培养，6 d后观察记录菌落的生长情况。

1.2.2?不同杀菌剂对辣木果腐病菌菌丝生长的影响

采用生长速率法测定不同杀菌剂对辣木果腐病菌菌丝生长的影响[21]。根据预试验的结果，按照系列浓度梯度稀释法，将每种供试药剂制成5个质量浓度的含药平板（表1）。用直径为5 mm的打孔器从活化后的菌落边缘打取菌饼，将病原菌接种在含药平板上，以加入灭菌水为对照，每处理设3次重复，28 ℃ 培养6 d后观察各处理的生长情况。“十”字交叉法测量菌落直径，计算生长抑制率。

生长抑制率=[（对照菌落直径-0.5）-（处理菌落直径-0.5）]/（对照菌落直径-0.5）×100%。以质量浓度对数为横坐标，生长抑制率几率值为纵坐标绘制毒力曲线，计算EC50、EC75，并比较各药剂的毒力大小。

2?结果与分析

2.1?辣木果腐病菌的生物学特性

2.1.1?不同培养基对菌丝生长的影响

由图1可知，菌株在供试的7种培养基中均能生长，在V-8汁、YEPD、PDA培养基中生长较快，菌落平均直径分别为7.98、7.88、7.77 cm，且三者间无显著性差异;其次为PCA培养基，菌落直径为 7.42 cm;在Czapek培养基中生长速度最慢，平均菌落直径为4.18 cm，显著低于其他培养基。从菌落形态和颜色来看，病菌在其他培养基中气生菌丝生长致密，Czapek培养基中气生菌丝较稀疏。

2.1.2?温度对病原菌菌丝生长的影响

由图2可知，病原菌在10～35 ℃之间都能生长，适宜温度范围为28～30 ℃，最适温度为30 ℃，培养6 d后菌落直径达到7.09 cm，显著高于其他温度下菌落直径。病原菌菌丝对高温和低温较敏感，超过30 ℃或低于20 ℃菌丝生长受到严重抑制，低于10 ℃菌丝停止生长，说明病原菌在低温环境下传播受限。

2.1.3?pH值对病原菌菌丝生长的影响

由图3可知，病原菌菌丝在pH值3～11范围内均能生长，在pH值7～9均有较好长势，pH值为8时菌落直径最大，培养6 d后菌落直径达到6.25 cm，pH值为3、11时菌丝生长都明显受阻。病原菌菌丝对酸碱的适宜范围比较广，但更适宜在弱碱性环境下生长，强酸、强碱环境都会明显抑制。

2.1.4?病原菌菌丝的致死温度

设置13个温度对病原菌菌丝进行处理，由表2可知，在40～49 ℃处理下菌丝均能形成新菌落，在50 ℃处理下不能形成新菌落，说明病原菌菌丝的致死温度为50 ℃处理10 min。

2.1.5?不同碳源对病原菌菌丝生长的影响

由图4可知，病原菌对可溶性淀粉利用率较高，菌丝生长较快，培养6 d后菌落直径达到7.08 cm，显著高于其他培养基;其次为山梨醇和果糖，菌落直径分别为4.90、4.50 cm，但二者之间具有显著差异;对半乳糖的利用率最差，菌丝长势最慢，菌落直径为 1.23 cm，显著低于其他碳源。

2.1.6?不同氮源对病原菌菌丝生长的影响

由图5可知，在含酵母浸膏的培养基上病原菌长势最快，对氮源的利用率最高，培养6 d后菌落直径达到7.27 cm，显著高于其他氮源;其次为牛肉浸膏，菌落直径为6.47 cm。在含L-天冬酰胺、甘氨酸、NaNO3、L-丙氨酸、NH4Cl、色氨酸、尿素、酪氨酸、L-精氨酸、胱氨酸、（NH4）2SO4的培养基上病原菌长势明显减弱，显著低于酵母浸膏和牛肉浸膏。在胱氨酸培养基上菌丝生长最慢，直径为3.38 cm。说明病原菌对氮源的利用范围较广，但对有机氮源的利用率更高。

2.1.7?不同光照条件对病原菌生长的影响

由表3可知，3种光照条件下病原菌都能正常生长，24 h黑暗条件下更有利于菌丝生长，显著高于其他光照条件下的菌落直径，说明病源菌对光照较为敏感。

2.2?供试杀菌剂对病原菌菌丝的生长抑制作用

由表4可知，250 g/L丙环唑乳油、450 g/L咪鲜胺水乳剂、70%甲基硫菌灵可湿性粉剂、25%三唑酮可湿性粉剂、10%苯醚甲环唑水分散粒剂、250 g/L嘧菌酯悬浮剂、50%多菌灵可湿性粉剂7种药剂对辣木果腐病菌的毒力较强，抑菌效果较好，对辣木果腐病菌的EC50在0.050 5～2.462 1 mg/L之间，其中450 g/L咪鲜胺水乳剂和250 g/L嘧菌酯悬浮剂的EC50分别为0.050 5、0.063 5 mg/L，均<0.1 mg/L，对辣木果腐病菌的抑菌效果最佳;80%代森锰锌可湿性粉剂、75%百菌清可湿性粉剂、50%异菌脲可湿性粉剂的抑菌效果较差，其中50%[CM（24]异菌脲可湿性粉剂对辣木果腐病菌的抑菌效果最差，EC50为52.698 7 mg/L。

3?讨论与结论

炭疽菌属真菌分布广泛，寄主范围较广，从单子叶植物到双子叶植物、从裸子植物到被子植物均能危害[22-23]。该属真菌可为害植物各个部位，引发各种农作物的炭疽病，造成叶斑、叶枯、花腐、果腐和枝枯等症状，影响植物的生长发育，降低作物品质，严重时可造成落花、落果，甚至植株死亡，导致农作物减产[24]。果腐病作为辣木上的重要病害，造成辣木籽失收，并严重影响其品质。目前，辣木果腐病菌的生物学特性研究还未见报道。本研究通过单因子变量试验分析不同条件对病原菌菌丝生长的影响，结果表明，病原菌最适温度范围为 28～30 ℃，与火龙果炭疽菌最适温度30 ℃[25]、橡胶炭疽病菌最适温度28 ℃相符[26]，也与辣木生长的适宜温度相符。辣木果腐病菌的pH值适应范围较广，该菌在pH值为3～11环境下均能生长，对碳源和氮源利用范围较广，对营养要求不高，该病菌对环境的适应性较强，有利用病原菌的传播。

10种常用杀菌剂室内毒力测定结果显示，450 g/L咪鲜胺水乳剂和250 g/L嘧菌酯悬浮剂对病菌的抑菌效果最好，EC50分别为0.050 5、0.063 5 mg/L，这与枇杷心腐病菌（C. acutatum）[27]、西瓜炭疽病菌（C. orbiculare）[28]等炭疽菌的研究相符，这2种药剂可考虑用于田间防治，生产上未见报道。咪鲜胺为咪唑类杀菌剂，通过抑制甾醇的生物合成，干扰病菌麦角甾醇合成过程中的C14脱甲基反应[29]。嘧菌酯为甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，通过在细胞色素b和C1间电子转移抑制线粒体呼吸，具有内吸性[30]。250 g/L 丙环唑乳油、70%甲基硫菌灵可湿性粉剂、10%苯醚甲环唑水分散粒剂、50%多菌灵可湿性粉剂对病原菌也具有较好的抑制效果，其 EC50 <1 mg/L，可作为防治辣木果腐病的备选药剂，但长期使用单一农药容易产生抗药性。唐爽爽等将不同作用机制的嘧菌酯与咪鲜胺按有效成分配比 2 ∶1 的比例混配，结果发现对抑制西瓜炭疽病菌具有增效作用[28]。炭疽菌对多种杀菌剂易产生抗药性，在生产中应避免长期使用单一药剂。本研究仅对单一杀菌剂进行了室内毒力测定，下一步将对效果较好的杀菌剂进行不同配比的联合毒力测定及田间药效试验。

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