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白菜类作物开花时间相关基因CCA1的克隆及功能标记开发

范文

刘东让侯喜林肖栋

摘要：以1年生的油用型品种Yellow sarson（YS-143）与2年生的芜菁品种Vegetable turnip（VT-044）的cDNA为模板，克隆出CCA1基因cDNA全长序列，分析其核苷酸多态性。在这2份材料构建的200株F2分离群体中，选取极早和极晚开花的单株各24株，对在亲本上鉴定到的4个多态性位点进行PCR扩增，采用Pearson相关性分析研究基因型与开花时间表现型的关系。构建pEZS-NL-CCA1载体，利用亚细胞定位技术，分析CCA1基因在真核细胞中的表达情况。序列分析表明，YS-143与VT-044分别有1 665、1 647个核苷酸，分别编码了554、548个氨基酸。亲本之间核苷酸序列分析鉴定到12个差异位点，氨基酸同源进化树分析表明，十字花科的不结球白菜、大白菜、萝卜、油菜、拟南芥、亚麻芥聚集在同一分支中，而禾本科的大麦、玉米、水稻聚集在另一分支中。在F2分离群体上，Pearson相关性鉴定到位于亲本第727至第732个碱基处的1个多态性位点（ACCCTT/ACCCTT），有该位点的群体单株平均开花时间为39 d，极显著早于缺失该位点的群体单株平均开花时间104 d（P<0.01），表明白菜类作物CCA1基因的第727至第732个碱基的缺失（A05：472204-472209）与开花时间呈极显著相关，影响开花时间，可为光周期敏感的白菜类作物晚抽薹育种研究提供一定的理论依据。开发的该Insert/Delete（InDel）标记，可以作为功能分子标记进行辅助育种工作，以加快育种进程。亚细胞定位结果表明，CCA1基因主要在细胞核上表达。

关键词：白菜类作物;开花时间;CCA1;InDel标记;亚细胞定位

中图分类号： S634.01?文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）20-0084-07

白菜类作物（Brassica rapa）属于十字花科（Cruciferae）芸薹属（Brassica），是我国乃至世界范围内重要的蔬菜和油料作物，主要包括大白菜、小白菜、芜菁、菜薹、紫菜薹、白菜型油菜等多种类型[1]。油用白菜类作物包括春性和冬性欧洲生态类型、我国特有的白菜型油菜和印度的Sarson类型，以根茎膨大为主要特征的芜菁类型是较原始的白菜类作物栽培种[2]。白菜类作物在开花习性上有1年生和2年生之分，在抽薹、开花时间上存在很大的差异。因此，白菜类作物是研究抽薹、开花变异、育种和遗传的良好体系[3]。

开花时间是白菜类作物生产中重要的农艺性状，是其从营养生长到生殖生长的重要标志，先抽薹、开花的现象直接影响了其产量和品质[4-5]。开花时间是由其内源发育信号和多种环境因素共同调控的，其中环境温度和光周期是主要影响因子[6]。Nelson等对起源于欧洲和澳大利亚的1年生夏季甘蓝型油菜进行了光周期敏感性观察，同时对不同光周期（长日照、短日照）条件下的131份双单倍体（double haploid）群进行了开花时间（天数）和开花时叶片数调查，发现该亲本及群体开花时间受光周期影响[7]。Huang等的研究表明，植物开花的光周期调控途径涉及复杂的昼夜节律（生物钟）调控网络，昼夜节律（生物钟）核心振荡子包括CCA1和LATEELONGATEDHYPOCOTYL（LHY）等MYB类转录因子[8]。在拟南芥中，CCA1基因通过与TIMING OF CABEXP RESSION 1（TOC1）和LHY基因相互作用形成一个生物钟的反馈环，即CCA1和LHY基因表达达到一定量会抑制TOC1基因的表达，而TOC1基因表达量升高则会促进CCA1和LHY基因表达，进而调控植物对昼夜变化做出响应，是维持生物钟节律的必需组分[9-11]。研究者已经在芸薹属的多种类型中测序发现，CCA1存在多个多态性位点，表明CCA1序列变异可用于开发与育种性状相关的分子标记[12]。张志刚等利用CCA1基因在2个敏感性不同的大白菜品种上第329 bp（第4外显子）处和第1 407 bp（第7外显子）处的2段序列差异开发出2个InDel标记，用于区分2个大白菜品种的耐抽薹性[13]。Yi等对3个芜菁自交系（RCBr、Kenshin 和Chiifu）的DNA序列进行分析，在CCA1基因第4内含子上开发出1个InDel标记[12]。白菜类作物种类繁多，仅在大白菜和芜菁上进行克隆序列的比较和标记的开发具有一定局限性，而且一般认为外显子上的变异比内含子上的变异更有可能影响植物的表型。在我国春季及高寒地区的秋冬白菜类作物生产中，先期抽薹、开花常常成为降低蔬菜产量和品质的重要难题[1]。因此，选育耐抽薹、晚开花的优质新品种，已经成为白菜类作物育种中的重要目标，开发白菜类作物不同类型CCA1基因的分子标记，可为分子标记辅助育种提供一定的理论依据[14]。

本研究选用早开花的油用型品种YS-143与晚开花的芜菁品种VT-044为试材，分别观察其在长日照和短日照2个条件下的开花时间，同时以这2个材料为模板克隆CCA1基因的cDNA序列，并利用生物信息学技术对其氨基酸序列进行分析，开发出1个InDel标记，最后通过验证，将其作为功能标记进行辅助育种工作，同时利用亚细胞定位技术鉴定了CCA1基因在细胞中的表达位置。

1?材料與方法

1.1?试验材料

以白菜类作物中纯合的1年生油用型品种YS-143（B. rapa L. ssp. oleifera）和2年生芜菁品种VT-044（B. rapa L. em. Metzg. ssp. rapa）及它们构建的F2分离群体为试材。亲本用于不同光周期对开花时间的敏感性观察及鉴定多态性差异位点，F2代分离群体用于多态性差异位点的验证。

RNAsimple Total RNA Kit试剂盒、PrimeScriptTM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒，购自TaKaRa公司;AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒，购自Axygen公司;pEAZY-Blunt载体及大肠杆菌感受态细胞DH5α购自北京全式金生物技术有限公司;高保真酶MIX（Ⅰ-5TM2×High-Fidelity Master Mix）购自江苏南京擎科生物科技有限公司;JS-3000全自动凝胶成像分析仪，购自上海培清科技有限公司。

1.2?试验方法

1.2.1?光周期敏感试验?2017年8月3号，将亲本材料种子20粒分别在铺有滤纸的培养皿里催芽，25 ℃暗培养36 h后播种在穴盘里，分别置于长日照（光照16 h/黑暗8 h）、短日照（光照8 h/黑暗16 h），温度22 ℃/18 ℃，相对湿度70%，光照度72 μmol/（m2·s）的光培箱中生长，1个月后定植花盆（17 cm）。同时，将F2代分离群体200株也播种在穴盘中，置于塑料大棚生长3周以后，于2017年8月24日至12月26日定植于南京农业大学句容农博园塑料大棚内，按照单株顺序编号，正常田间管理。调查亲本和F2代分离群体的开花时间，调查标准为从催芽到第1朵花开放所需要的时间（天数）。

1.2.2?CCA1基因克隆?使用RNAsimple Total RNA Kit试剂盒提取2个亲本的总RNA，具体方法参照说明书。cDNA使用PrimeScriptTM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒反转录合成，作为基因克隆所需的模板。CCA1基因序列参照已发表的大白菜基因组序列（http：//brassicadb.org/brad/），使用在线软件Primer 3（http：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）设计特异扩增的PCR引物，并由江苏南京擎科生物科技有限公司合成（表1）。PCR扩增体系总体积为40 μL：正反引物各 2 μL、模板cDNA 1 μL、高保真酶MIX 20 μL、ddH2O 15 μL。PCR反应程序：98 ℃预变性2 min;98 ℃变性10 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸10 s，35个循环;72 ℃延伸5 min;10 ℃保存。cDNA质量的检验采用琼脂糖凝胶电泳方法，取5 μL DNA加入6×Loading Buffer后用1.2%琼脂糖电泳检测，GelRed染色，用JS-3000全自动凝胶成像分析仪进行凝胶照相。凝胶回收方法参照AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒。目的片段胶回收后连接到pEAZY-Blunt载体上，转化进大肠杆菌感受态细胞DH5α中，选择阳性单克隆送至江苏南京擎科生物科技有限公司测序。

1.2.3?序列分析?用BioXM 2.7软件分析2份材料CCA1基因序列的开放阅读框（open reading frame，ORF）。不同物种CCA1基因的氨基酸序列从NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库中搜索获得;同源性计算利用NCBI网站BLAST程序;氨基酸编码的蛋白质相对分子质量、理论等电点、不稳定指数等通过在线软件ProtParam（https：//web. expasy.org/Protparam/）完成;亲/疏水性预测采用ProtScale（https：//web. expasy.org/protscale/）;信号肽预测采用SignalP4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/）;跨膜区域预测采用TMHMM 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）;蛋白质结构域分析采用InterPro（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）;蛋白质二级结构预测采用PSIPRED（http：// bioinf.cs.ucl.ac.uk /psipred/）等在线工具;多重序列比对及进化树构建通过DNAMAN 5.2进行[15]。

1.2.4?功能标记开发?提取F2代群体极早和极晚开花植株各24株叶片的DNA，具体方法参照Axygen植物基因组DNA提取试剂盒说明书。对亲本中鉴定到的CCA1编码区多态性位点（InDels）设计特异引物进行PCR扩增，扩增产物送江苏南京擎科生物科技有限公司测序（表1）。采用t测验分析亲本的开花时间差异显著性。以InDel标记基因型作为自变量，采用单因素方差分析候选标记（InDel）与开花时间表型的相关性，统计学分析过程中所用的软件是SPSS 19.0。

1.2.5?CCA1基因的亚细胞定位分析?根据YS-143中克隆出的CCA1基因序列和亚细胞定位载体pEZS-NL序列，设计含有EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点的特异引物（表1）。用One Step Cloning Kit构建载体pEZS-NL-CCA1，具体操作方法参照说明书。用基因枪法转化洋葱表皮细胞[16]，取洋葱表皮，将其靠叶肉面向上铺于MS固体培养基上培养4 h待用，取8 μL金粉悬浮液于1.5 mL离心管中，依次加入5 μg质粒DNA、50 μL 2.5 mol/L CaCl2、20 μL 0.1 mol/L亚精胺，冰浴20 min，其间间歇振荡混匀。10 000 r/min离心5 s，弃上清，加入无水乙醇漂洗2次，弃上清，最后加入20 μL无水乙醇，悬浮待用。用基因枪轰击洋葱表皮，轰击后暗培养16 h制片，用激光共聚焦显微镜进行观察，并拍照记录。

2?结果与分析

2.1?亲本开花时间统计

由图1可知，10株亲本材料YS-143在长日照条件下平均开花时间为（48±10） d，短日照条件下为（96±10） d;10株VT-044在长日照條件下平均开花时间为（105±15） d，短日照条件下在统计时间内没有开花，记为200 d。通过t测验发现，这2个亲本在不同光周期处理下的开花时间均差异极显著。由此证明，2个亲本开花时间均受光周期影响，均为光周期敏感性材料。

2.2?CCA1基因克隆及序列分析

由图2可知，YS-143的cDNA序列长度为1 665 bp，VT-044的序列长度为1 647 bp，除了前者比后者多了4段共18 bp的插入外，整个编码区还有8处SNPs，其中2处是非同义突变。经预测，第1段插入使YS-143的CCA1蛋白第110位后的氨基酸插入Arg和Lys 2个残基;第2段插入使 YS-143的CCA1蛋白第242位后的氨基酸插入Thr和Leu 2个残基;第3段使YS-143的CCA1蛋白第263位后的氨基酸插入Gly残基;第4段使YS-143的CCA1蛋白第504位后的氨基酸插入Leu残基;另外2处非同义突变分别是 YS-143 的CCA1蛋白第158位氨基酸由Val突变为Leu、第467位氨基酸由Gln突变为Lys。

由图3可知，YS-143的基因序列包含1个长为1 665 bp的ORF;该基因编码554个氨基酸，预测其编码蛋白质化学式为C2591H4095N781O867S14，相对分子质量为60.5 ku，理论等电点为6.20，不稳定指数为46.60，脂肪指数为57.33。ProtScale亲/疏水性预测显示，该蛋白属于亲水性蛋白，平均亲水指数为-0.872。蛋白二级结构预测结果显示，其主要为α螺旋和无规则卷曲，分别占21.01%、76.45%，其余为延伸链。VT-044 的基因序列包含1个长为1 647 bp的ORF;该基因编码548个氨基酸，预测其编码蛋白质化学式为 C2559H4033N771O861S14，相对分子质量为59.8 ku，理论等电点为5.98，不稳定指数为46.18，脂肪指数为56.35。ProtScale亲/疏水性预测显示，该蛋白属于亲水性蛋白，平均亲水指数为 -0.877。蛋白二级结构预测结果显示，其主要为α螺旋和无规则卷曲，分别占23.5%、73.59%，其余为延伸链。2个基因所编码蛋白质均属于不稳定蛋白，无信号肽和分泌蛋白，也不存在跨膜区域，并且均在第19至第73氨基酸区域内有3个MYB-DNA结合域。

2.3?CCA1基因编码的氨基酸序列同源性和系统进化分析

利用BLASTp分别对YS-143和VT-044的CCA1氨基酸序列进行同源性检索与多重比对，结果（图4、图5）显示它们与大白菜（登录号为XP_009142594.1）相似性接近100%，与甘蓝型油菜（登录号为XP_013712324.1）和萝卜（登录号为XP_018441166.1）相似性分别为92%、73%，与拟南芥（登录号为NP850460.1）和亚麻芥（登录号为XP_010518363.1）相似性在65%以上，其中N端的MYB-DNA结合域的氨基酸序列相似度接近100%;与大麦（登录号为BAJ92173.1）、玉米（登录号为BAJ92173.1）和水稻（登录号为AAR20887）的相似性均在35%以下，表明同科植物的氨基酸序列相似度较高。同源进化树分析表明，十字花科的不结球白菜、大白菜、萝卜、甘蓝型油菜、拟南芥、亚麻芥聚集在同一分支中，而禾本科的大麦、玉米、水稻聚集在另一分支中。

2.4?功能标记开发

将4个InDel标记在极早和极晚开花植株上的测序结果与植株开花时间进行关联分析，发现第2处标记（第727至第732个碱基的缺失）与材料开花时间关联极显著，其余3处不显著。测序发现在F2代的24株极早开花的植株中，该位点基因型为ACCCTT/ACCCTT的有18株（与早花型母本YS-143一致），占总株数的75%，开花时间为31～56 d，平均开花时间39 d，基因型为ACCCTT/-的有3株，-/-的有3株;在24株极晚开花的植株中，该位点基因型为ACCCTT/ACCCTT的有0株，ACCCTT/-的有4株，基因型为-/-的有20株（与晚花型父本VT-044一致），占总株数的83%，开花时间为84～114 d，平均开花时间为104 d。因此，该位点基因型为ACCCTT/ACCCTT的植株开花时间远早于基因型为-/-的植株的开花时间，两者之间呈极显著差异（P <0.01）（图6）。该InDel标记基因型和开花时间表型的Pearson相关性分析表明，材料开花时间的早晚与基因型呈极显著相关（r=0.991，P<0.01）。表明CCA1基因的第727至第732个碱基的变异（A05：472204-472209）与开花时间呈极显著相关，会影响植株的开花时间，可以为白菜类作物光周期影响开花时间的研究提供理论依据。同时，该位点可以作为功能分子标记进行辅助育种工作，加快育种进程。

2.5?CCA1基因的亚细胞定位分析

利用亚细胞定位在线预测软件WoLF PSORT（http：//www.genscript.com/psort.html）对CCA1基因在细胞中表达的位置进行预测，显示CCA1基因有91.3%的可能性定位在细胞核上。而通过在洋葱表皮中进行的亚细胞定位试验（图7）发现，在阳性对照中，细胞膜、细胞质和细胞核上都能观察到绿色荧光?而来源YS-143的CCA1蛋白的荧光信号主要集中在细胞核上，说明CCA1基因主要在细胞核上发挥功能。

3?讨论与结论

在光周期条件下，白菜类作物具有不同的敏感性反应。张学铭对100份白菜类作物抽薹开花性状的光周期敏感性进行调查，发现具有较大差异[3]。本研究所用材料YS-143在长日照条件下平均开花时间为（48±10） d，短日照条件下为（96±10） d;VT-044在长日照条件下平均开花时间为（105±15） d，短日照条件下在统计时间内没有开花。因此，选取的YS-143和VT-044均为光周期敏感类型，可以作为试验材料进行光周期变化对开花时间影响的研究。

研究者分别从杨树、大麦、玉米等植物中克隆到了相应的CCA1基因，分子进化关系表明，它们之间氨基酸序列的同源性较高，且在单、双子叶植物间非常保守，其N端的核酸结构域的氨基酸序列相似度高达79%以上[17-19]。这与本研究结果类似，笔者也发现2个材料与大白菜、甘蓝型油菜、萝卜的基因序列具有较高同源性，与拟南芥、亚麻芥的进化距离也较近，其中N端的核酸结构域的氨基酸序列相似度接近100%。Yi等对来自3个芜菁自交系（RCBr、Kenshin、Chiifu）的CCA1基因序列进行了分析，在第4内含子上鉴定出高水平的序列变异，并据此开发出1个InDel标记，进而分别用PCR及HRM（high-resolution melting）技术2种方法对其进行验证，均证明该第4内含子上的序列变异可以作为InDel分子标记参[CM（25]与芜菁的育種工作[12]。张志刚等在2个大白菜品种上克隆CCA1基因的cDNA序列，分别在329 bp（第4外显子）处和第1 407 bp（第7外显子）处开发出2个InDel分子标记，并利用PCR法进行了验证[13]。本研究选择更有可能对植物表型造成影响的外显子序列进行分析，将分别在第330 bp（第4外显子）、第726 bp（第6外显子）、第789 bp（第6外显子）和第1 515 bp（第7外显子）处鉴定到的4段序列差异与F2代分离群体的开花时间进行关联分析，发现位于第726 bp处的序列差异与开花时间相关，其余3段不相关。其中第4外显子上的序列差异与张志刚等鉴定到的序列[13]位置相近、序列相同。同时笔者也发现，F2群体中基因型为ACCCTT/ACCCTT的植株的开花时间并不是都早于基因型为-/-的植株。其主要原因可能是开花时间并不只受CCA1基因控制，而是受多个开花时间相关基因和多条路径相互协调、共同调控的。在拟南芥中，发现CCA1基因定位在细胞核上[20]。本研究通过亚细胞定位试验发现，不结球白菜YS-143中的CCA1基因在细胞核上表达，表明在拟南芥到白菜类作物进化过程中，CCA1基因依然在细胞核中发挥原有的作用。

已有研究指出，在现代育种中改良某个特定的优良性状最有效的途径就是选择携带某一性状的目的基因的供体亲本进行回交，同时利用各种分子标记进行辅助选择，迅速地将与分子标记连锁的基因转移到另外一个品种上，从而显著加速育种年限[21]。本研究关于CCA1基因功能标记的开发与利用，可为白菜类作物分子标记辅助育种提供一定的理论依据和现实意义，为开发通用的白菜类作物InDel标记提供了重要的一步。

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