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新疆某规模化驴场奶驴乳房炎的临床及实验室诊断

范文

高静雯曾宗波武磊张莉齐亚银

摘要：为查明导致新疆某规模化驴场奶驴乳房炎的主要致病菌及其发病原因，首先进行了现场流行病学调查，后对20头奶驴（13头患乳房炎、7头健康）的血常规进行检测，并无菌采集13头临床型奶驴乳房炎的奶样，采用常规微生物学方法进行病原菌的分离鉴定及药敏试验。研究结果表明，本次乳房炎的发生与奶驴营养不良和养殖环境差息息相关，其中乳房炎组与健康组相比，血红蛋白、红细胞、淋巴细胞、粒细胞比例等均有所下降，其余指标变化不明显。同时，从乳汁中共分离鉴定到16株细菌，其中大肠杆菌13株，链球菌3株;药敏试验结果表明，大肠杆菌对链霉素、恩诺沙星、氟苯尼考的敏感率都在75%以上，对β-内酰胺类药物耐药率在60%以上;链球菌对青霉素、氨苄西林、氟苯尼考的敏感率都在60%以上，但对恩诺沙星耐药率达到100%。研究结果揭示，尽管关于奶驴乳房炎发病率的报道较少，但通过本次试验发现，在生产环节中各种细菌对奶驴乳房炎的威胁不容小觑，且本次分离到的病原菌已经表现出比较严重的耐药性。

关键词：驴;乳房炎;生化鉴定;药敏试验;血细胞分析

中图分类号： S858.22?文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）20-0196-04

乳房炎是奶牛和奶山羊的常见高发病，产奶驴也有发生，以乳房发热、肿胀、疼痛、乳汁不通为主[1]。驴乳房炎，主要是由于驴乳腺受微生物、物理、化学和环境等因素刺激从而产生的一类炎症反应。驴和其他马属动物一样，哺乳期能产奶，奶驴泌乳期一般可达到7～8个月，驴的产乳量：驴产奶因品种不同标准不一，产后1.5～4个月处于高产期，日单产最高可达3.5～4.0 kg，平均1.5～1.8 kg[2]。驴奶具有较高的开发利用价值，Malacarne等发现驴奶具有极高的营养价值，其主要成分与人奶非常相近，可作为人乳的替代品，同时还具有较高的药用价值，《本草纲目》中记载：“驴乳，气味甘，冷利，无毒，热频饮之可治气郁，解小儿热毒，不生痘疹”[3]。因此，驴乳房炎不仅对养殖户造成严重的经济损失，更对动物性食品安全与畜牧行业的发展造成了巨大的安全隐患。

2018年6月，新疆某规模化驴场在采集驴奶时发现驴奶出现异常，其中有13头驴出现典型乳房炎症状，奶汁呈絮状，黄褐色泛黑。驴乳房炎给驴场带来了奶产量和奶质量降低、驴奶的废弃，甚至患驴的淘汰等较大的经济损失。本研究对该规模化驴场中病驴进行驴乳房炎致病菌的分离鉴定，并对这13头采样驴和7头健康驴进行血细胞成分分析测定，旨在明确引起驴乳房炎的主要病原菌种类，并探讨乳房炎患驴和健康驴血细胞成分的关系。

1?试验材料

1.1?病料来源

采集新疆某规模化驴场明显发作驴乳房炎的13头驴的奶样。采集时，先对乳头进行消毒，弃掉前5～10 mL驴乳后无菌采集乳样5 mL左右。

1.2?主要试剂和仪器

培养基：LB肉汤、LB琼脂、伊红-美兰琼脂（EMB）;麦康凯培养基（MAC）均购自北京奥博星生物科技有限责任公司;脑心浸出液肉汤（BHI）（青岛高科园海博生物技术有限公司）;羊血琼脂;链球菌选择培养基。

鉴定用培养基及试剂：硫化氢、苯丙氨酸、葡萄糖酸盐、蛋白胨水、葡磷胨水、枸橼酸盐、尿素、赖氨酸、鸟氨酸、棉子糖、山梨醇、侧金盏花醇、木胶糖、七叶苷（青岛高科技生物园海博生物有限公司）。

药敏纸片：包括β-内酰胺类3种：青霉素（10 μg，P）、氨苄西林（10 μg，AMP）、阿莫西林（10 μg，AMC）;氨基糖苷类2种：庆大霉素（10 μg，GEN）、链霉素（10 μg，STR）;喹诺酮类1种：恩诺沙星（15 μg，ENR）;酰胺醇类1种：氟苯尼考（30 μg，FFC）;大环内酯类1种：红霉素（10 μg，E）;均购自杭州微生物試剂有限公司。

仪器：显微镜（型号CX21FS1），血细胞分析仪（XFA6100A型），隔水式恒温培养箱（北京市永光明医疗仪器厂），净化工作台（上海鸿都电子科技有限公司）。

2?试验方法

2.1?现场流行病学调查及血常规分析

2.1.1?现场流行病学调查

采用现场流行病学调查的手段和方法，查找导致该次奶驴乳房炎暴发的主要因素，包括天气、环境、饲养、挤奶情况以及发病率、死亡率等。

2.1.2?血常规检测

从该标准化驴场通过颈静脉采血的方法[4]，采集13头发病驴的血液和7头健康母驴的血液进行血细胞成分的检测。

判定标准：参考《兽医检验》[5]和姜生成等的研究中驴的血细胞成分标准[6]进行分析（表1）。

2.2?细菌分离、培养及纯化

首先加入适量采集的奶样到普通LB肉汤进行 12 h 摇床培养，然后分别接种到不同的固体培养基上，包括LB平板、麦康凯培养基及血平板上，置于37 ℃温箱培养 24 h，观察菌落及菌体的形态学特征;然后挑取单个菌落进行纯化，保存菌株，待进一步进行鉴定。

2.3?细菌的生化鉴定

将纯化后的单个菌落分别接种于硫化氢、苯丙氨酸、葡萄糖酸盐、蛋白胨水、葡磷胨水、枸橼酸盐、尿素、赖氨酸、鸟氨酸、棉子糖、山梨醇、侧金盏花醇、木胶糖、七叶苷等鉴定培养基中，37 ℃培养6～48 h，观察试验结果（表2）。

2.4?药敏试验

药物敏感性试验按照CLSI推荐的K-B（Kirby-Bauer）法进行[7]，将纯化的菌株分别在LB肉汤培养18～24 h，用移液枪吸取500 μL菌液置于普通LB琼脂平板上，用涂布器进行涂匀，反复、多次涂抹，待菌液快干燥时，在平板上均匀贴上5片不同的药敏纸片，置于温箱培养18～24 h后测量抑菌环的直径，根据抑菌圈的大小判断其对抗菌药的敏感性。判定标准见表3。

3?试验结果

3.1?现场流行病学调查结果

养殖规模：挤奶驴872头，公驴23头。

发病时间：2018年6月份。

挤奶设备：移动式手工辅助挤奶设备，主要依靠人工挤奶，挤奶时未做消毒处理。

发病率与死亡率：13头驴出现典型乳房炎症状，奶汁呈絮状，黄褐色或者黑色;无奶驴死亡。

饲养方式及营养比例：半舍饲化饲养，主要饲喂玉米秸秆、玉米及少量苜蓿，均采用自由采食方式。

3.2?血常规检测结果

检测发病驴和健康驴的血液，由表4可知，健康驴的血细胞的数据都是在驴血细胞标注的数据范围内有小幅度波动;发病驴的血细胞大部分数量相比下降了，红细胞、血红蛋白、粒细胞比率及淋巴细胞比率均有所下降。

3.3?细菌分离纯化及形态学结果

将13份奶样进行接种培养，分离出16株可疑菌株，通过麦康凯培养基、伊红-美蓝培养基、以及链球菌选择培养基的培养，观察其菌落及菌体的形态，其中13株菌疑似大肠杆菌（图1），3株疑似链球菌（图2）。所有株菌在普通LB培养基上都长出边缘光滑且规则的菌落，其中13株菌落较大1.0～2.5 mm，3株菌落较小直径为1.0～1.5 mm;13株菌在麦康凯培养基上长出粉红色圆滑的菌落（图3），在伊红-美蓝培养基上长出具有金属光泽的菌落（图4），革兰氏染色镜检可见革兰氏阴性、粉红色、两端钝圆的短杆状菌[8];剩余3株菌在链球菌选择培养基上长出了圆形、隆起、光滑、湿润、露滴状菌落（图5），同时在血平板上长出了光滑、伽马-溶血状、半透明边缘的菌落[9]（图6）。

3.4?生理生化鉴定结果

对分离纯化的细菌进行生理生化特性鉴定，进一步探究细菌的特性?观察鉴定试剂的颜色变化情况以及是否有产酸产气情况等，结果见表5。

由表5可知，疑似为大肠杆菌的13株菌生化鉴定结果基本一致，有产酸产气现象，蛋白胨水和葡磷胨水都变成红色阳性，赖氨酸脱羧酶试验阳性，能发酵山梨醇、棉子糖、侧金盏花醇和木胶糖，其生化特性符合大肠杆菌的特性[10];另外3株菌的生化鉴定显示其能发酵山梨醇、棉子糖、木胶糖，并且不能使七叶苷水解，其特性基本符合链球菌的特征。

3.5?药敏试验结果

由表6可知，2类菌同时对链霉素和氟苯尼考都是高敏的;大肠杆菌对氟苯尼考最敏感，敏感率92%;对恩诺沙星和链霉素敏感率分别84.6%和76.9%;对β-内酰胺类药物较为耐药，氨苄西林和阿莫西林耐药率均是61.5%，青霉素更是100%耐药。链球菌则是对氨苄西林、阿莫西林和氟苯尼考有100%的高度敏感率;对青霉素和链霉素也较为敏感，敏感率为66.7%;对恩诺沙星则完全耐药。

4?分析与讨论

导致各种动物乳房炎的最直接原因主要是病原微生物的感染[11]，例如葡萄球菌、链球菌、大肠埃希菌、变形杆菌、沙门氏菌、肠杆菌属、棒状杆菌属、酵母菌、支原体等[12]。其中大肠杆菌性乳房炎常引起急性炎症，使乳房炎从隐性乳房炎转变为临床型[13]，链球菌性乳房炎往往是由于饲养环境造成的。试验结果表明，发病驴血红蛋白和红细胞数量相对减少，淋巴细胞不具有吞噬作用，其比例下降说明自身免疫力下降;粒细胞比率下降，白细胞数量明显增多，说明由于有炎症反应，导致其产生抗体来抵抗病原菌，这与张银亮关于乳房炎的发生与免疫力之间相关性的内容相符[14]。同时该驴场的饲养管理差、环境不良、营养水平低也是导致发生乳房炎的诱因，而且对发病驴群也没有采取隔离措施，挤奶设备也没有分开使用。

近年，乳房炎在奶牛上为高发病，因此研究得也较为透彻，而驴的乳房炎鲜有报道。根据药敏试验及血常规分析，分离株已经表现明显的耐药性，建议该场采用中药和高敏抗炎药物相结合的方式进行该病的综合防控[1]，尤其要有“防大于治”的思维，定期对驴奶进行乳液中体细胞数量检测或CMT（加州乳房炎检测法）进行检测，避免隐性乳房炎转变为临床型乳房炎[15]。

本研究通过现场流行病学调查、血常规检测和细菌的分离鉴定及药敏相结合的方式，查明了导致新疆某规模化驴场奶驴乳房炎的发病原因，为控制该场奶驴乳房炎的蔓延提供了科学依据，同时为进一步研究驴乳房炎提供了科学支撑。

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