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1株三型丁香假单胞菌猕猴桃致病变种细菌全基因组扫描图测序及分析

范文

邓博涵刘丹蕾陈秋菊

摘要：丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv. actinidiae，简称Psa）是引起猕猴桃细菌性溃疡病的病原菌。对从感染溃疡病的东红猕猴桃枝条中分离得到的1株Psa野生株（命名为GX05）进行全基因组测序，获得基因组草图，分析其中毒力基因、耐药基因和致病基因的情况。研究发现，多位点序列分型结果显示GX05为biovar 3，与毒力因子数据库比对，GX05携带99种毒力因子及692个相关毒力基因，同源性和匹配度最高的毒力因子是PvdL和Irp1;与综合抗生素抗性基因数据库比对，GX05携带336种耐药基因，与29种抗生素有关;与病原宿主互作数据库比对，不表达导致病原菌致病力减弱的基因数量最多，其中同源性和匹配度最高的是PvdL，此外与增强致病力相关的同源性和匹配度最高的基因是hrcC。通过全基因组测序信息初步分析了1株三型Psa菌株中存在的毒力、耐药及致病基因情况，对深入研究其致病机制和合理用药有重要意义。

关键词：丁香假单胞菌猕猴桃致病变种;猕猴桃细菌性溃疡病;全基因組测序;毒力基因;耐药基因;致病基因

中图分类号：S436.634.1+9?? 文献标志码： A? 文章编号：1002-1302（2020）20-0067-08

猕猴桃细菌性溃疡病严重威胁着猕猴桃产业的发展，给世界猕猴桃产业造成了巨大损失[1]，丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv. actinidiae，简称Psa）是猕猴桃细菌性溃疡病的致病菌[2]。研究发现，原本健康的猕猴桃植株在春季初次出现溃疡病症状（如叶斑）后，年底便会死亡。溃疡病的传播速度快、危害大，1年便可毁坏整个猕猴桃园[3-4]。目前还没有直接杀灭病原菌的有效措施[5]，主要的防治方法包括以铜制剂为主的化学防治[6-7]、以链霉素为主的生物防治[8-9]、果园管理[10]和抗性品种选育[11]等。化学和生物防治可造成植物毒性、药物残留、产生耐药细菌等缺点，并且基因水平转移可使耐药基因在细菌间流动[12]，目前已有报道表明部分Psa对链霉素[13]和铜制剂[14]产生了抗性。

寻找猕猴桃细菌性溃疡病的有效防治途径是全球猕猴桃产业面临的重要任务。已发现的Psa有5种生物型，分别为biovar 1、biovar 2、biovar 3、biovar 5、biovar 6。我国目前只发现biovar 3群体[15]，但其致病机制尚不明确。有关Psa的研究主要集中在群体结构、病原菌鉴定、防控药物筛选等方面，对毒力基因、耐药基因和致病基因的研究报道较少。本试验对1株从贵州省贵阳市修文县古堡镇猕猴桃养殖基地采集的患病东红猕猴桃（Actinidia chinensis “Donghong”）枝条中分离出的Psa进行全基因组扫描图测序，分别与毒力因子数据库、综合抗生素抗性基因数据库和病原宿主互作数据库等进行比较，筛选出与毒力基因、耐药基因和致病基因同源性最高的基因组，利用基因组信息从分子水平揭示病原菌的致病机制，为Psa的致病机制研究提供理论积累。

1 材料与方法

1.1 菌株的分离纯化

2018年3月在贵州省贵阳市修文县古堡镇的猕猴桃园内采集感染猕猴桃溃疡病的东红猕猴桃枝条。在无菌环境下，削取枝条病部，置于无菌的生理盐水中，27 ℃振荡10 min，接种于1.5%NB固体培养基（国药集团化学试剂有限公司）表面，参考马志宏等的方法[16]进行平板划线纯化。倒置平板于恒温培养箱中，27 ℃培养24 h，挑单菌落于NB液体培养基中，于27 ℃恒温摇床中180 r/min摇菌 16 h。吸取最后一轮纯化的菌液于无菌离心管中离心后弃上清，收集菌体沉淀用于提取DNA和浸染烟草试验。

1.2 菌株基因组DNA的提取与菌种鉴定

根据细菌基因组DNA小量纯化试剂盒[宝日医生物技术（北京）有限公司]说明书提取基因组DNA，用27F/1492R通用引物进行16S rDNA测序[由生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序]，测序结果在NCBI数据库（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中进行核酸BLAST比对，筛选出属于Psa的菌株。

1.3 烟草过敏反应

细菌缓冲液（100 mL）成分包括1 mL的1 mol/L MgCl2、1 mL的1 mol/L 2-（N-吗啉代）乙烷磺酸一水（用KOH调整pH值至5.6）和100 μL的 100 μmol/L 乙酰丁香酮。用配制好的缓冲液将细菌沉淀悬浮，调整浓度为D600 nm=0.5，避光3～4 h后备用。在本氏烟草叶片背面用注射器针头轻微划伤，将无针注射器压在伤口处，轻轻往里注射，使菌液直径扩散至2 cm左右。处理组（接种细菌悬浮液）和对照组（直接注射缓冲液）各选择5个叶片进行接种，24 h后观察叶片的变化情况。

1.4 抗生素敏感性试验

采用纸片扩散法，选择11种抗生素进行抗生素敏感性试验。用无菌的生理盐水稀释菌液至0.5麦氏浊度，用无菌涂布棒均匀涂抹菌液至整个NB琼脂平板，镊子灭菌后夹取各药敏纸片（杭州微生物试剂有限公司）于平板正中。每种药敏片做3个平行，进行3次生物学重复，每个抑菌圈统计3个直径，计算平均值，判断抗生素敏感性[17]。

1.5 GX05全基因组测序

将GX05的基因组DNA送往上海美吉生物医药科技有限公司二代测序平台Illumina Hiseq×10进行测序。使用短序列组装软件SOAPdenovo2[18]对二代测序后的经过滤得到的有效数据进行多个 K-mer 参数的拼接，得到最优的重叠群（contigs）组装结果。随后通过将测序读长（reads）比对到contig上，对组装结果进行局部组装和优化，获得基因组骨架（scaffolds）。使用CGview[19]软件绘制基因组圈图。使用Glimmer 3[20]软件预测编码基因，使用Tandem Repeats Finder软件[21]进行串联重复序列预测。按照管家基因在标准株Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000基因组上的位置，使用biovar 1～biovar 6型以及Pfm菌株[15]的管家基因以gapA-pgi-rpoD-gyrB-pfk-acn的顺序串联[22]，使用MEGA 7.0用Tamura-Nei模型和近邻法进行系统发育分析[23]。比对病原菌毒力因子数据库（virulence factors of pathogenic bacteria，简称VFDB）[24]，综合抗生素抗性基因数据库（comprehensive antibiotic resistance database，简称CARD）[25]和病原与宿主互作数据库（pathogen host interactions，简称PHI）[26]分别获得毒力基因、耐药基因和致病基因的信息。

2 结果与分析

2.1 Psa菌株的分离与鉴定

经过多轮纯化后分离得到的Psa菌株在NB平板上的菌落形态呈光滑圆形，白色半透明状。16S rDNA测序结果在NCBI数据库经过BLAST比对，结果显示与Psa菌株（序列号：MH071159.1）相似度为98.24%，判断为Psa菌株，命名为GX05。

2.2 烟草过敏反应

图1-a、图1-b分别为注射细菌悬浮液（处理）和无菌缓冲液（对照）的烟草，注射范围约2 cm，呈现出水渍状。24 h后，处理组叶片的注射部位出现明显的黄色枯斑，产生了过敏反应（图1-c），而对照组叶片注射无菌缓冲液的部位水渍消失，叶片

恢复正常状态（图1-d），说明分离纯化所得的Psa野生株GX05具有相应的致病性。

2.3 抗生素敏感性试验结果

由表1、图2可知，Psa菌株GX05对磷霉素、多黏菌素、卡那霉素、氨曲南、羧苄青霉素、阿洛西林、美罗培南、头孢噻肟等表现为敏感，对替考拉宁、杆菌肽和阿莫西林表现为耐药。

2.4 Psa菌株GX05全基因组测序结果

Psa GX05进行全基因组测序后，对获得的片段进行过滤和组装，得到251条scaffolds，总长度为 6 212 819 bp（图3）， N50 为 46 356 bp。长度大于 1 000 bp 的scaffolds有223条，共6 195 265 bp，最大的scaffold长度为181 097 bp，鸟嘌呤-胞嘧啶（G+C）含量为58.53%。经预测，基因组的编码基因总长度为5 180 589 bp，共有5 725个。非编码区有57个tRNA，9个rRNA，包括1个23S rRNA1个16S rRNA、7个5S rRNA，有195个串联重复序列，占基因组的0.97%。根据多位点序列分型（MLST）构建的系统发育树结果可知，GX05属于biovar 3型Psa（图4）。

2.5 Psa菌株GX05毒力因子分析

VFDB數据库预测到692个毒力基因，其中367个毒力基因注释为99种毒力因子，52种毒力因子的功能分属于攻击型毒力因子（28种）、防御型毒力因子（11种）、非特异性毒力因子（11种）和调控毒力基因的毒力因子（2种），剩余的47种没有功能归类。按照打分由高到低的条件筛选，同源性和匹配

度最高的2个毒力因子与铁载体（siderophore）有关：荧光铁载体（pyoverdine，简称PVD）肽合成酶PvdL以及合成耶尔森菌素（yersiniabactin）有关的耶尔森菌素生物合成蛋白Irp1。另外经统计，共匹配到51个PVD合成相关毒力基因（表2，未完全显示，仅显示同源性最高的10个基因）和4个非荧光铁载体（pyochelin）合成相关的毒力因子[Fe（Ⅲ）-pyochelin receptor precursor、salicylate biosynthesis isochorismate synthase PchA、salicylate biosynthesis protein PchB、ABC transporter ATP-binding protein]。

2.6 Psa菌株GX05耐药基因分析

通过与CARD数据库比对分析，预测GX05携带366个耐药基因，与29种抗生素有关（图5）。经ARO（Antibiotic Resistance Ontology）注释，GX05有5种耐药机制，分别为抗生素外排、抗生素靶标改变、抗生素失活、抗生素靶标替代和抗生素靶标保护。外排泵系统的基因数量最多，主要包括macB（31个）、oleC（14个）、evgS（13个）、drrA（13个）等253个相关抗生素耐药基因本体，其中根据score打分，同源性和匹配度最高的10个基因中与外排泵有关的基因是mexF、mexK、MexB、TriC、MexN。

2.7 Psa菌株GX05致病基因分析

PHI数据库注释预测GX05携带有959个与宿主病原菌互作相关的基因，属于8种表现型：缺失导致病原菌致病力减弱的基因643个、对病原菌致病性没有影响的基因172个、导致病原菌致病能力丧失的基因99个、使病原菌致病能力增强的基因68个、致病效应基因34个、致死因子18个、抗药基因3个、感药基因2个。比对结果按照得分打分，同源性和匹配度最高的是不表达导致病原菌致病能力减弱的并与铁载体有关的基因PvdL，此外与增强病原菌致病能力有关并且同源性和匹配度最高的基因是三型分泌系统通路上的基因hrcC。当筛选作用宿主为拟南芥时，高度匹配得到5个基因，其中AvrE1、hrcC、HopD1等3个基因与植物感染后叶片出现细菌性斑点的症状有关（表3）。

3 讨论与结论

由于红阳猕猴桃和黄金果猕猴桃的栽培面积最广、经济价值高，所以全世界对猕猴桃溃疡病的关注点主要集中于这2个品种，对其他患有猕猴桃细菌性溃疡病的猕猴桃品种的研究较少。本研究是首次对从患病的东红猕猴桃枝条中分离出的Psa（菌株命名为GX05）进行全基因组扫描图测序，并且着重分析耐药基因以及同源性和匹配度最高的毒力基因和致病基因。

注射烟草和真空渗透叶盘的结果证明Psa菌株GX05有致病力。从使用MLST构建的系统发育树结果来看，GX05属于biovar 3。biovar 3是我国目前发现唯一存在的Psa群体[15]，也是目前全世界最普遍流行的Psa群体[27]。在5种生物型中，biovar 3的致病力最强[28]，但其致病机制尚不明确。Hacker等发现，病原菌的致病性取决于位于毒力岛上的多种毒力基因[29-30]，而各种毒力因子的组合与平衡对于Psa的致病性（毒力）来说很重要[27]。目前对感染溃疡病的东红猕猴桃的研究主要以调查其发病情况[31]和抗性评价[32]为主，针对致病菌Psa致病及乃耐药机制的研究尚未见报道。因此本研究着重关注了导致东红感染猕猴桃细菌性溃疡病的Psa菌株的毒力和致病基因以及导致其产生耐药性的原因。本次测序结果得到的GX05基因组大小为6 212 819 bp，与NCBI数据库中丁香假单胞菌的基因组大小（6.1 Mp）接近。根据全基因组测序结果，通过分析毒力基因和致病基因，筛选出3个同源性最高且最具代表性的基因：PvdL、Irp1、hrcC;分析耐药基因发现，该菌携带多种类型的耐药基因，并且以外排泵系统基因为主。

本研究预测到692个毒力基因，同源性和匹配度最高的基因与铁载体的合成有关。Marcelletti等对2株Psa biovar 1和1株biovar 3菌株基因组的草图进行研究，发现它们均携带一组编码铁载体（铁载体是假单胞菌属细菌的重要毒力因子[34]）的基因，例如PVD、肠杆菌素（enterobactin）和耶尔森菌素[33]。Lamont等发现，PVD在铜绿假单胞菌中可以调控外毒素A、PrpL等其他毒力因子的表达[35];Wooldridge等发现，PVD参与调控生物膜的形成，增加病原菌的耐药性[36]。从测序结果来看，GX05的基因组中共计匹配到51个合成荧光铁载体相关毒力基因，覆盖了PVD合成、分泌和作用途径，其中PvdL的同源性最高。结合GX05中PVD的存在可以初步判定，Psa分离株具有与铜绿假单胞菌相似的毒力因子和致病机制，生物膜的形成是Psa产生耐药性的主要原因。Irp1广泛存在于假单胞菌属的细菌中[37]，编码耶尔森菌素生物合成蛋白[38]，与合成、摄取铁载体有关[39]，引起番茄和拟南芥的细菌性叶斑病[40]。测序结果预测显示，Irp1是与增强Psa致病力有关同源性最高的基因。因此，Psa可能通过Irp1来调控铁载体和其他铁吸收系统，从而在猕猴桃中繁殖并增强Psa的感染能力，这可能是Psa破坏力强大并造成毁园的主要原因。但目前Psa中还没有Irp1功能研究的相关报导。此外，感染溃疡病的猕猴桃叶片出现叶斑的原因也可能与Irp1有关。Mccann等研究发现，Psa通过Ⅲ型分泌效应因子感染猕猴桃[41]，而hrcC蛋白是组成Ⅲ型分泌系统的外膜蛋白[42]，可以引起非宿主植物（如烟草）的过敏反应并使宿主植物感病[43]。本次的全基因组测序数据显示，同源性最高的互作基因是hrcC。因此，携带hrcC的Ⅲ型分泌系统可能是引起Psa感染猕猴桃并使得叶片出现细菌性斑点的原因之一。目前对于Psa的毒力因子和病原菌宿主互作的研究主要集中于Ⅲ型分泌系统中的avr和hop基因[27]，而hrcC的存在为完善Psa分泌系统通路提供了新的途径。通过CARD预测到GX05携带多种耐药基因，以外排泵系统产生抗生素耐药性为主。外排泵能够将进入细菌体内的抗生素排出[44]，因此GX05可能主要靠外排泵系统产生耐药性。药敏试验发现，GX05对替考拉宁、杆菌肽和阿莫西林表现出了耐药性，这3种抗生素分别属于糖肽类抗生素、多肽类抗生素和青霉类抗生素，与预测到的信息相匹配。

首先从患病的东红猕猴桃枝条中分离出Psa（菌株命名为GX05），并对其进行烟草过敏反应试验和抗生素敏感性试验，最后对其基因组进行扫描图测序。分析发现，其致病机制主要是与PVD的合成和分泌有关，并发现其导致叶片出现叶斑病的是Irp1致病基因。这为进一步研究Psa的致病机制提供了新的思路，在未来可以寻找影响Psa的铁载体和外排泵系统发挥作用的方法来治疗猕猴桃细菌性溃疡病。

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