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标题 阿莫西林在鸡蛋中的残留消除规律研究
范文

    桑卡娜 杨绒娟 李召斌 张文君 赵永峰 晏磊 周德刚

    

    

    

    摘要?[目的]考察阿莫西林可溶性粉在雞蛋中的残留消除规律,确定其休药期,防止其在临床上的不合理使用。[方法]选取2组健康成年已开产蛋鸡分别灌服不同厂家的阿莫西林,剂量均为100?mg/kg体重,连续用药5?d。给药期间至给药后14?d进行取样,每日每组取鸡蛋15枚,使用ELISA试剂盒进行阿莫西林残留检测,并用WT1.4软件计算阿莫西林的休药期。[结果]2组均在停药后第1天药物浓度达到最高值,阿莫西林在鸡蛋中的休药期分别为12.74和12.72?d。[结论]阿莫西林在鸡蛋中的残留时间较长,且不同厂家的阿莫西林在鸡蛋中的休药期无差异。

    关键词?阿莫西林;鸡蛋;药物残留;休药期

    中图分类号?S859.84文献标识码?A文章编号?0517-6611(2020)07-0110-03

    doi:10.3969/j.issn.0517-6611.2020.07.032

    Study?on?the?Residual?and?Elimination?Laws??of?Amoxicillin?Residues?in?Eggs

    SANG?Kana,?YANG?Rongjuan,?LI?Zhaobin?et?al

    (Luoyang?Huizhong?Animal?Medicine?Co.,Ltd.,National?Research?Center?for?Veterinary?Medicine,Luoyang,Henan?471003)

    Abstract?[Objective]?To?investigate?the?rule?of?residual?elimination?of?amoxicillin?in?eggs,?determine?the?withdrawal?period?and?prevent?its?unreasonable?use?in?clinic.?[Method]?Two?groups?of?healthy?adult?laying?hens?were?fed?with?amoxicillin?from?different?manufacturers?at?a?dose?of?100?mg/kg?body?weight?for?5?days.?Samples?were?taken?during?the?administration?period?to?14?days?after?the?administration,?15?eggs?were?taken?from?each?group?daily.?ELISA?kit?was?used?to?detect?the?amoxicillin?residues?and?WT1.4?software?to?calculate?the?withdrawal?period.?[Result]?Drug?concentration?in?the?both?groups?reached?the?highest?values?on?the?first?day?after?discontinuation.?The?withdrawal?period?of?amoxicillin?in?eggs?in?two?groups?was?12.74?and?12.72?d?respectively.[Conclusion]?Amoxicillin?has?a?longer?residual?time?in?eggs,?and?there?was?no?significant?difference?in?the?drug?withdrawal?period?between?the?different?manufacturers?of?amoxicillin?in?eggs.

    Key?words?Amoxicillin;Eggs;Drug?residue;Withdrawal?period

    作者简介?桑卡娜(1990—),女,河南驻马店人,兽医师,硕士,从事兽医药理毒理研究、兽药残留检测等工作。

    通信作者,高级兽医师,硕士,从事新兽药研发与开发工作。

    收稿日期?2019-10-08;修回日期?2019-10-25

    阿莫西林(Amoxicillin)又名羟氨苄青霉素,是一种最常用的青霉素类广谱β-内酰胺类抗生素,具有杀菌能力强、口服吸收好、血药浓度高且不受食物影响的特点[1],在医学和兽医临床上应用广泛。在实际养殖临床用药中的不规范使用,导致阿莫西林在动物各组织中的残留,一方面引起细菌耐药菌株的产生,另一方面摄入青霉素残留超标的动物可食性组织,经胃肠道吸收容易造成过敏反应[2]和其他对身体的潜在危害。

    阿莫西林残留量检测是当前中国、欧盟和北美等国家对动物性食品的必检项目之一[3]。大多数国家均对阿莫西林在动物食品中的最高残留限量(MRLs)作出了规定。2002年,原农业部第235号公告规定了动物性食品中兽药最高残留限量(maximumresidue?limits,MRLs),其中阿莫西林在组织中的MRLs为50?μg/kg,在牛奶中的MRLs为10?μg/kg[4];日本厚生省颁布的《食品中农业化学品残留限量》则规定阿莫西林在鸡组织中MRLs为50?μg/kg,在鸡蛋中为10?μg/kg[5];欧盟规定阿莫西林和氨苄西林在所有动物性食品中的MRLs为50?μg/kg,在牛奶中为4?μg/kg[6]。

    笔者研究了阿莫西林在鸡蛋中的残留消除规律,规范阿莫西林在养殖中的科学合理合规使用,分析其不合理使用及滥用后对人类健康的潜在危害,旨在为保障动物源性食品和人类生命健康提供理论依据。

    1?材料与方法

    1.1?试验材料

    1.1.1?试验药物。

    阿莫西林可溶性粉,有效成分30%,包装规格100?g/袋,生产厂家为河南某公司;

    阿莫西林可溶性粉,有效成分30%,包装规格100?g/袋,生产厂家为山东某公司。

    1.1.2?试验动物。

    健康成年已开产蛋鸡90只,28周龄左右,体重为(1.80±0.20)kg。试验前预饲14?d,饲喂不含任何抗菌药物的全价饲料,自由饮水。

    1.1.3?试验仪器与耗材。

    电子天平,规格0.1~1?000.0?g,为常熟市金羊砝码仪器有限公司产品;阿莫西林残留酶联免疫检测试剂盒,批号20190614,购自北京勤邦生物技术有限公司;其他耗材有脚标、5?mL注射器灌胃管等。

    1.2?试验方法

    1.2.1?试验分组。

    成年健康已开产蛋鸡90只,利用EXCEL随机数字生成器分别对90只蛋鸡随机选择,分为3组,每组30只。其中Ⅰ组为试验组给予河南某公司的阿莫西林可溶性粉,Ⅱ组为对照组给予山东某公司的阿莫西林可溶性粉,Ⅲ组为空白对照组,不给药,正常饲喂不含任何抗菌药物的全价饲料。对所有鸡只进行给药前称重,依据称重结果进行给药。

    1.2.2?给药方法。

    阿莫西林按100?mg/kg体重剂量口服给药,每日2次,连用5?d。投药时将阿莫西林可溶性粉用水配成净含量为40?mg/mL的水溶液。药物现配现用,具体给药方法见表1所示。

    1.2.3?样品收集与编号。

    鸡蛋样品均在每天17:30—18:00收集,在收集后及时保存于4?℃冰箱中。收集日期为给药期间(5?d)至停止给药14?d。所有鸡蛋编号原则为组别/日期。

    1.2.4?样品检测。

    采用阿莫西林残留酶联免疫检测试剂盒,对采集的鸡蛋样品进行药物含量检测。

    1.2.4.1?标准曲线的绘制。

    根据试剂盒说明,取试剂盒中阿莫西林各标准品溶液,测定不同浓度标准品吸光度值,以百分吸光率[(B/B0)×100%](B值为标准品或样本溶液的平均吸光度值,B0为0?μg/kg?标准溶液的平均吸光度值)为纵坐标,以不同标准品浓度的对数值为横坐标,绘制标准曲线,并推导出回归方程,进行相关回归分析。

    1.2.4.2?试剂盒加标回收率试验。

    取一定体积的阿莫西林标准品溶液添加至空白鸡蛋样品,使样品的药物含量分别为100、20、10?μg/kg,每个浓度的样品做2次平行。

    阿莫西林鸡蛋样品前处理方法如下:称取(1.0±0.05)g均质后的鸡蛋样本至10?mL聚乙烯离心管中加入2?mL去离子水,用涡旋仪涡动1?min,3?000?r/min室温(20~25?℃)下离心5?min移取200?μL上清液至1.5?mL聚乙烯离心管中,再加入200?μL复溶工作液,用涡旋仪涡动1?min,混匀,取50?μL用于分析。

    1.2.4.3?试剂盒精确度试验。

    取一定体积的阿莫西林标准品溶液添加至空白鸡蛋样品,使样品的药物含量分别为100、20、10?μg/kg,按试剂盒提供的方法样品预处理后进行检测。同一天内每个浓度重复5个样品,取平均值,计算日内变异系數。

    1.2.4.4?阿莫西林在雞蛋中的含量检测。

    检测前,首先将所有的试剂必须恢复到室温23~27?℃,任何不用的试剂须立即置于4?℃下保存。将采集的样品按照步骤“1.2.4.2”相应的方法进行前处理。处理后,按照试剂盒的方法进行检测。

    预试验:停止给药后1、3、7?d,每组各取2个样品,进行检测,考察样品浓度是否在标准曲线范围内,若样品浓度过高,需对样品进行一定的稀释后,再次进行检测。

    正式试验:每次检测时,均需制备2条标准曲线,保证此次检测结果的可靠性。每个时间点,各组均检测10个样品,保证结果的真实性。

    1.3?数据分析

    通过试剂盒专用的数据处理软件Ridawin,绘制标准曲线,对样品检测数据进行计算,得到对应的药物浓度值,药物浓度以μg/kg为单位。

    每个时间点的鸡蛋中的药物浓度均10枚鸡蛋的平均值()±标准差(SD)表示,以此考察阿莫西林在鸡蛋中的残留消除。参考沈建忠等在2000年报道的国内常用实测浓度判断法,该方法是以所有被检测动物的各组织中药物残留量均低于MRLs所需要的时间作为休药期[7]。同时,使用WT1.4软件按95%置信区间计算阿莫西林在鸡蛋的休药期(WDT)。

    2?结果与分析

    2.1?样品采集

    按照给药方法对鸡只进行给药,在第1天给药后进行鸡蛋采集,每组每日均采集15枚鸡蛋,剩余鸡蛋弃去。试验期间共采集19?d,共收集855枚鸡蛋。

    2.2?标准曲线的制作

    取试剂盒中的阿莫西林标准物(0、1.5、4.5、13.5、40.5、121.5?μg/kg)进行ELISA测定,以百分吸光率为纵坐标,以不同标准品浓度的对数值为横坐标,绘制标准曲线,进行回归分析,可知阿莫西林酶联免疫试剂盒的线性关系良好(图1)。

    2.3?加标回收率试验

    取一定体积的阿莫西林标准品溶液添加至空白鸡蛋样品,使样品的药物含量分别为100、20、10?μg/kg,每个浓度做2个平行。样品前处理后检测,结果表明阿莫西林100、20、10?μg/kg的回收率分别为81.1%、852%和123.0%,与试剂盒说明书基本保持一致。

    2.4?精确度试验

    取一定体积的阿莫西林标准品溶液添加至空白鸡蛋样品,使样品的药物含量分别为100、20、10?μg/kg,每个浓度重复检测5次,计算变异系数,结果见表2。由表2可知,阿莫西林试剂盒的变异系数为4.02%,变异系数小于10%,表明重复性良好。

    2.5?样品的检测

    2.5.1?预试验结果。

    停药后1、3、7?d的鸡蛋样品,每组各取2个样品,检测结果如表3所示。标准曲线最高浓度为121.5?μg/kg,前处理过程样品被稀释6倍,则最高可检测浓度为729?μg/kg。由上述检测最高浓度约387?μg/kg,未超过标曲最高线。因此,样品不需要稀释,可以直接进行检测。

    2.5.2?正式检测。

    每组每个时间点检测10个样品,空白对照组为未给药的空白鸡蛋,检测结果均小于10?μg/kg,2个给药组的具体检测结果见表4。由表4可知,2组在给药期间药物浓度不断升高,且均在停药后第1天药物浓度达到最高值,此后逐步降低;停药后第9天后药物浓度均低于10??μg/kg。

    2.6?休药期的计算

    2.6.1?实测浓度判断法。

    在中国和欧美国家,鸡蛋中阿莫西林均无最低残留限量(MRLs),仅日本公布的鸡蛋中阿莫西林的最低残留限量(MRLs)为10?μg/kg。由检测结果可知,2个厂家的阿莫西林均在停药后第9天检测浓度低于10?μg/kg,按照实测浓度法可判定其休药期为停药后第9天。

    2.6.2?WT?1.4软件计算法。

    采用WT?1.4软件按95%置信区间计算阿莫西林在鸡蛋的休药期(WDT)。阿莫西林在鸡蛋中的休药期数据拟合图见图2、3。由图2、3可知,Ⅰ组和Ⅱ组阿莫西林在鸡蛋中的休药期分别为12.74和12.72?d。

    3?讨论与结论

    在中国和欧美国家,鸡蛋中阿莫西林均无最低残留限量(MRLs),仅日本公布的鸡蛋中阿莫西林的最低残留限量(MRLs)为10?μg/kg。该试验依据阿莫西林的给药说明书(30%),按100?mg/kg体重剂量口服给药,一日2次,连用5?d。结果表明,2个厂家的阿莫西林均在停药后第1天,鸡蛋中药物残留量达到最高值;药物残留量在停药后迅速降低,且均在停药后第9天检测浓度低于MRLs(10?μg/kg),2个厂家的阿莫西林药物代谢消除曲线基本重合。

    休药期(WDT)是指从停止给药到允许动物屠宰或其产品上市的间隔时间。WDT可简单理解为从停止给药到保证组织中残留浓度降至低于安全浓度MRLs需要的时间。WDT的计算方法主要有实测浓度判断法[7]、回归法[8]、群体药动学方法[9]和非参数方法[10]。

    沈建忠等[7]报道的国内常用实测浓度判断法,是以所有被检测动物各组织的药物残留均低于MRLs所需时间为休药期。根据国内实测浓度判断法,可初步判定阿莫西林在鸡蛋的休药期为停药后第9天。

    美国FDA规定使用回归法测定WTD。该方法是将浓度作对数转换后与时间做线性回归,将回归曲线的95%可信限的上限降至MRLs所需要时间为休药期[8]。故一般经常使用休药期软件WT?1.4,采用回归法计算得出的休药期。采用WT?1.4软件按95%置信区间计算阿莫西林在鸡蛋的休药期(WDT),2个厂家的阿莫西林再鸡蛋中的休药期分别为12.74和12.72?d。

    Liu等[11]2017年研究表明,在25和50?mg/kg的剂量下,全蛋中所有残留物的理论消除时间分别为8.00和911?d。

    Xie等[12]2013年研究表明,50?mg/kg剂量下在全蛋中在停药后第10.5天,彻底检测不到阿莫西林。与该试验检测结果休药期(12.74?d)基本保存一致。该试验中阿莫西林在鸡蛋中的代谢曲线与文献[11-12]报道基本一致,均在停药后第1天左右达到药物浓度最高值。孙礼瑞等[13]在2015年研究报道的阿莫西林在鸡组织中的残留消除规律,结果是休药后第5天阿莫西林残留量低于最高残留限量(50?μg/kg);该试验中鸡蛋样品在停药后第5天药物残留量为40.22?μg/kg,与文献报道基本一致。

    迄今为止,国内外关于阿莫西林在鸡蛋中的残留研究极少,且多采用高效液相和质谱等的检测方法,但其前处理方法复杂,包含液液提取、固相萃取净化和衍生化等多步提取。该研究采用酶联免疫试剂盒,快速检测鸡蛋中的阿莫西林残留量,通过回收率和灵敏度验证,证明方法的科学性和可行性。开展2个不同厂家的阿莫西林在蛋鸡中的残留消除试验,试验结果与文献报道的消除曲线基本一致,且2个厂家的阿莫西林,在鸡蛋中的残留情况基本无差异。

    该试验结果表明,蛋鸡在使用阿莫西林后,其在鸡蛋中休药期较长(12.74?d),且不同厂家的阿莫西林在鸡蛋中的休药期无差异,为临床提供相关的科学数据和快速检测的方法,防止兽医临床上的不合理使用,保障动物源性食品安全。

    参考文献

    [1]?谢恺舟,陈学森,徐东,等.高效液相色谱荧光检测法检测鸡蛋中阿莫西林残留[J].食品科学,2012,33(22):264-268.

    [2]?BOSI?P,MERIALDI?G,SCANDURRA?S,et?al.Feed?supplemented?with?3?different?antibiotics?improved?food?intake?and?decreased?the?activation?of?the?humoral?immune?response?in?healthy?weaned?pigs?but?had?differing?effects?on?intestinal?microbiota[J].?Journal?of?animal?science,2011,89:4043-4053.

    [3]?吳永宁,邵兵,沈建忠.兽药残留检测与监控技术[M].北京:化学工业出版社,2007.

    [4]?中华人民共和国农业部.动物性食品中兽药最高残留限量:公告第235号(附录4)[S].北京:中华人民共和国农业部,2002.

    [5]?日本肯定列表制度.食品中农业化学品残留限量-?药品巻[M].北京:中国标准出版社,2006.

    [6]?European?Union.Commission?Regulation(EU)No?37/2010of?22?December?2009?on?pharmacologically?active?substances?and?their?classification?regarding?maximum?residue?limits?in?food?stuffs?of?animal?origin[Z].2010.

    [7]?沈建忠,钱传范,江海洋,等.马杜霉素在鸡组织中残留消除及临床毒性的研究[J].畜牧兽医学报,2000,31(5):458-463.

    [8]?INTORRE?L,CASTELLS?G,CRISTFOL?C,et?a1.Residue?depletion?of?thiamphenicol?in?the?seabass[J].J?Vet?Pharmacol?Therap,2002,25(1):59-63.

    [9]?WHITTEN?T.Pharmacokinetics?and?milk?discard?times?of?pirlimycin?after?intramammary?infusion:A?population?approach[J].J?Vet?Pharmacol?Therap,1999,22(1):41-51.

    [10]?CONCORDET?D,TOUTAIN?P?L.The?withdrawal?time?estimation?of?veterinary?drugs:A?nonparametric?approach[J].Joural?Vet?Pharmacol?Therap,1997,20(5):374-379.

    [11]?LIU?Y?N,PANG?M?D,XIE?X,et?al.Residue?depletion?of?amoxicillin?and?its?major?metabolites?in?eggs[J].Journal?of?veterinary?pharmacology?and?therapeutics,2017,40(4):383-391.

    [12]?XIE?K?Z,ZHAO?M,GUO?H?S,et?al.Determination?and?depletion?of?amoxicillin?residues?in?eggs[J].Food?additives?&?contaminants:Part?A,2013,30(4):670-677.

    [13]?孙礼瑞,谢星,张金玲,等.阿莫西林在鸡组织中的残留消除规律[J].中国兽医学报,2015,35(5):767-773.

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更新时间:2025/3/15 19:35:03