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阿莫西林在鸡蛋中的残留消除规律研究

范文

桑卡娜杨绒娟李召斌张文君赵永峰晏磊周德刚

摘要?[目的]考察阿莫西林可溶性粉在雞蛋中的残留消除规律，确定其休药期，防止其在临床上的不合理使用。[方法]选取2组健康成年已开产蛋鸡分别灌服不同厂家的阿莫西林，剂量均为100?mg/kg体重，连续用药5?d。给药期间至给药后14?d进行取样，每日每组取鸡蛋15枚，使用ELISA试剂盒进行阿莫西林残留检测，并用WT1.4软件计算阿莫西林的休药期。[结果]2组均在停药后第1天药物浓度达到最高值，阿莫西林在鸡蛋中的休药期分别为12.74和12.72?d。[结论]阿莫西林在鸡蛋中的残留时间较长，且不同厂家的阿莫西林在鸡蛋中的休药期无差异。

关键词?阿莫西林;鸡蛋;药物残留;休药期

中图分类号?S859.84文献标识码?A文章编号?0517-6611（2020）07-0110-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.07.032

Study?on?the?Residual?and?Elimination?Laws??of?Amoxicillin?Residues?in?Eggs

SANG?Kana，?YANG?Rongjuan，?LI?Zhaobin?et?al

（Luoyang?Huizhong?Animal?Medicine?Co.，Ltd.，National?Research?Center?for?Veterinary?Medicine，Luoyang，Henan?471003）

Abstract?[Objective]?To?investigate?the?rule?of?residual?elimination?of?amoxicillin?in?eggs，?determine?the?withdrawal?period?and?prevent?its?unreasonable?use?in?clinic.?[Method]?Two?groups?of?healthy?adult?laying?hens?were?fed?with?amoxicillin?from?different?manufacturers?at?a?dose?of?100?mg/kg?body?weight?for?5?days.?Samples?were?taken?during?the?administration?period?to?14?days?after?the?administration，?15?eggs?were?taken?from?each?group?daily.?ELISA?kit?was?used?to?detect?the?amoxicillin?residues?and?WT1.4?software?to?calculate?the?withdrawal?period.?[Result]?Drug?concentration?in?the?both?groups?reached?the?highest?values?on?the?first?day?after?discontinuation.?The?withdrawal?period?of?amoxicillin?in?eggs?in?two?groups?was?12.74?and?12.72?d?respectively.[Conclusion]?Amoxicillin?has?a?longer?residual?time?in?eggs，?and?there?was?no?significant?difference?in?the?drug?withdrawal?period?between?the?different?manufacturers?of?amoxicillin?in?eggs.

Key?words?Amoxicillin;Eggs;Drug?residue;Withdrawal?period

作者简介?桑卡娜（1990—），女，河南驻马店人，兽医师，硕士，从事兽医药理毒理研究、兽药残留检测等工作。

通信作者，高级兽医师，硕士，从事新兽药研发与开发工作。

收稿日期?2019-10-08;修回日期?2019-10-25

阿莫西林（Amoxicillin）又名羟氨苄青霉素，是一种最常用的青霉素类广谱β-内酰胺类抗生素，具有杀菌能力强、口服吸收好、血药浓度高且不受食物影响的特点[1]，在医学和兽医临床上应用广泛。在实际养殖临床用药中的不规范使用，导致阿莫西林在动物各组织中的残留，一方面引起细菌耐药菌株的产生，另一方面摄入青霉素残留超标的动物可食性组织，经胃肠道吸收容易造成过敏反应[2]和其他对身体的潜在危害。

阿莫西林残留量检测是当前中国、欧盟和北美等国家对动物性食品的必检项目之一[3]。大多数国家均对阿莫西林在动物食品中的最高残留限量（MRLs）作出了规定。2002年，原农业部第235号公告规定了动物性食品中兽药最高残留限量（maximumresidue?limits，MRLs），其中阿莫西林在组织中的MRLs为50?μg/kg，在牛奶中的MRLs为10?μg/kg[4];日本厚生省颁布的《食品中农业化学品残留限量》则规定阿莫西林在鸡组织中MRLs为50?μg/kg，在鸡蛋中为10?μg/kg[5];欧盟规定阿莫西林和氨苄西林在所有动物性食品中的MRLs为50?μg/kg，在牛奶中为4?μg/kg[6]。

笔者研究了阿莫西林在鸡蛋中的残留消除规律，规范阿莫西林在养殖中的科学合理合规使用，分析其不合理使用及滥用后对人类健康的潜在危害，旨在为保障动物源性食品和人类生命健康提供理论依据。

1?材料与方法

1.1?试验材料

1.1.1?试验药物。

阿莫西林可溶性粉，有效成分30%，包装规格100?g/袋，生产厂家为河南某公司;

阿莫西林可溶性粉，有效成分30%，包装规格100?g/袋，生产厂家为山东某公司。

1.1.2?试验动物。

健康成年已开产蛋鸡90只，28周龄左右，体重为（1.80±0.20）kg。试验前预饲14?d，饲喂不含任何抗菌药物的全价饲料，自由饮水。

1.1.3?试验仪器与耗材。

电子天平，规格0.1～1?000.0?g，为常熟市金羊砝码仪器有限公司产品;阿莫西林残留酶联免疫检测试剂盒，批号20190614，购自北京勤邦生物技术有限公司;其他耗材有脚标、5?mL注射器灌胃管等。

1.2?试验方法

1.2.1?试验分组。

成年健康已开产蛋鸡90只，利用EXCEL随机数字生成器分别对90只蛋鸡随机选择，分为3组，每组30只。其中Ⅰ组为试验组给予河南某公司的阿莫西林可溶性粉，Ⅱ组为对照组给予山东某公司的阿莫西林可溶性粉，Ⅲ组为空白对照组，不给药，正常饲喂不含任何抗菌药物的全价饲料。对所有鸡只进行给药前称重，依据称重结果进行给药。

1.2.2?给药方法。

阿莫西林按100?mg/kg体重剂量口服给药，每日2次，连用5?d。投药时将阿莫西林可溶性粉用水配成净含量为40?mg/mL的水溶液。药物现配现用，具体给药方法见表1所示。

1.2.3?样品收集与编号。

鸡蛋样品均在每天17：30—18：00收集，在收集后及时保存于4?℃冰箱中。收集日期为给药期间（5?d）至停止给药14?d。所有鸡蛋编号原则为组别/日期。

1.2.4?样品检测。

采用阿莫西林残留酶联免疫检测试剂盒，对采集的鸡蛋样品进行药物含量检测。

1.2.4.1?标准曲线的绘制。

根据试剂盒说明，取试剂盒中阿莫西林各标准品溶液，测定不同浓度标准品吸光度值，以百分吸光率[（B/B0）×100%]（B值为标准品或样本溶液的平均吸光度值，B0为0?μg/kg?标准溶液的平均吸光度值）为纵坐标，以不同标准品浓度的对数值为横坐标，绘制标准曲线，并推导出回归方程，进行相关回归分析。

1.2.4.2?试剂盒加标回收率试验。

取一定体积的阿莫西林标准品溶液添加至空白鸡蛋样品，使样品的药物含量分别为100、20、10?μg/kg，每个浓度的样品做2次平行。

阿莫西林鸡蛋样品前处理方法如下：称取（1.0±0.05）g均质后的鸡蛋样本至10?mL聚乙烯离心管中加入2?mL去离子水，用涡旋仪涡动1?min，3?000?r/min室温（20～25?℃）下离心5?min移取200?μL上清液至1.5?mL聚乙烯离心管中，再加入200?μL复溶工作液，用涡旋仪涡动1?min，混匀，取50?μL用于分析。

1.2.4.3?试剂盒精确度试验。

取一定体积的阿莫西林标准品溶液添加至空白鸡蛋样品，使样品的药物含量分别为100、20、10?μg/kg，按试剂盒提供的方法样品预处理后进行检测。同一天内每个浓度重复5个样品，取平均值，计算日内变异系數。

1.2.4.4?阿莫西林在雞蛋中的含量检测。

检测前，首先将所有的试剂必须恢复到室温23～27?℃，任何不用的试剂须立即置于4?℃下保存。将采集的样品按照步骤“1.2.4.2”相应的方法进行前处理。处理后，按照试剂盒的方法进行检测。

预试验：停止给药后1、3、7?d，每组各取2个样品，进行检测，考察样品浓度是否在标准曲线范围内，若样品浓度过高，需对样品进行一定的稀释后，再次进行检测。

正式试验：每次检测时，均需制备2条标准曲线，保证此次检测结果的可靠性。每个时间点，各组均检测10个样品，保证结果的真实性。

1.3?数据分析

通过试剂盒专用的数据处理软件Ridawin，绘制标准曲线，对样品检测数据进行计算，得到对应的药物浓度值，药物浓度以μg/kg为单位。

每个时间点的鸡蛋中的药物浓度均10枚鸡蛋的平均值（）±标准差（SD）表示，以此考察阿莫西林在鸡蛋中的残留消除。参考沈建忠等在2000年报道的国内常用实测浓度判断法，该方法是以所有被检测动物的各组织中药物残留量均低于MRLs所需要的时间作为休药期[7]。同时，使用WT1.4软件按95%置信区间计算阿莫西林在鸡蛋的休药期（WDT）。

2?结果与分析

2.1?样品采集

按照给药方法对鸡只进行给药，在第1天给药后进行鸡蛋采集，每组每日均采集15枚鸡蛋，剩余鸡蛋弃去。试验期间共采集19?d，共收集855枚鸡蛋。

2.2?标准曲线的制作

取试剂盒中的阿莫西林标准物（0、1.5、4.5、13.5、40.5、121.5?μg/kg）进行ELISA测定，以百分吸光率为纵坐标，以不同标准品浓度的对数值为横坐标，绘制标准曲线，进行回归分析，可知阿莫西林酶联免疫试剂盒的线性关系良好（图1）。

2.3?加标回收率试验

取一定体积的阿莫西林标准品溶液添加至空白鸡蛋样品，使样品的药物含量分别为100、20、10?μg/kg，每个浓度做2个平行。样品前处理后检测，结果表明阿莫西林100、20、10?μg/kg的回收率分别为81.1%、852%和123.0%，与试剂盒说明书基本保持一致。

2.4?精确度试验

取一定体积的阿莫西林标准品溶液添加至空白鸡蛋样品，使样品的药物含量分别为100、20、10?μg/kg，每个浓度重复检测5次，计算变异系数，结果见表2。由表2可知，阿莫西林试剂盒的变异系数为4.02%，变异系数小于10%，表明重复性良好。

2.5?样品的检测

2.5.1?预试验结果。

停药后1、3、7?d的鸡蛋样品，每组各取2个样品，检测结果如表3所示。标准曲线最高浓度为121.5?μg/kg，前处理过程样品被稀释6倍，则最高可检测浓度为729?μg/kg。由上述检测最高浓度约387?μg/kg，未超过标曲最高线。因此，样品不需要稀释，可以直接进行检测。

2.5.2?正式检测。

每组每个时间点检测10个样品，空白对照组为未给药的空白鸡蛋，检测结果均小于10?μg/kg，2个给药组的具体检测结果见表4。由表4可知，2组在给药期间药物浓度不断升高，且均在停药后第1天药物浓度达到最高值，此后逐步降低;停药后第9天后药物浓度均低于10??μg/kg。

2.6?休药期的计算

2.6.1?实测浓度判断法。

在中国和欧美国家，鸡蛋中阿莫西林均无最低残留限量（MRLs），仅日本公布的鸡蛋中阿莫西林的最低残留限量（MRLs）为10?μg/kg。由检测结果可知，2个厂家的阿莫西林均在停药后第9天检测浓度低于10?μg/kg，按照实测浓度法可判定其休药期为停药后第9天。

2.6.2?WT?1.4软件计算法。

采用WT?1.4软件按95%置信区间计算阿莫西林在鸡蛋的休药期（WDT）。阿莫西林在鸡蛋中的休药期数据拟合图见图2、3。由图2、3可知，Ⅰ组和Ⅱ组阿莫西林在鸡蛋中的休药期分别为12.74和12.72?d。

3?讨论与结论

在中国和欧美国家，鸡蛋中阿莫西林均无最低残留限量（MRLs），仅日本公布的鸡蛋中阿莫西林的最低残留限量（MRLs）为10?μg/kg。该试验依据阿莫西林的给药说明书（30%），按100?mg/kg体重剂量口服给药，一日2次，连用5?d。结果表明，2个厂家的阿莫西林均在停药后第1天，鸡蛋中药物残留量达到最高值;药物残留量在停药后迅速降低，且均在停药后第9天检测浓度低于MRLs（10?μg/kg），2个厂家的阿莫西林药物代谢消除曲线基本重合。

休药期（WDT）是指从停止给药到允许动物屠宰或其产品上市的间隔时间。WDT可简单理解为从停止给药到保证组织中残留浓度降至低于安全浓度MRLs需要的时间。WDT的计算方法主要有实测浓度判断法[7]、回归法[8]、群体药动学方法[9]和非参数方法[10]。

沈建忠等[7]报道的国内常用实测浓度判断法，是以所有被检测动物各组织的药物残留均低于MRLs所需时间为休药期。根据国内实测浓度判断法，可初步判定阿莫西林在鸡蛋的休药期为停药后第9天。

美国FDA规定使用回归法测定WTD。该方法是将浓度作对数转换后与时间做线性回归，将回归曲线的95%可信限的上限降至MRLs所需要时间为休药期[8]。故一般经常使用休药期软件WT?1.4，采用回归法计算得出的休药期。采用WT?1.4软件按95%置信区间计算阿莫西林在鸡蛋的休药期（WDT），2个厂家的阿莫西林再鸡蛋中的休药期分别为12.74和12.72?d。

Liu等[11]2017年研究表明，在25和50?mg/kg的剂量下，全蛋中所有残留物的理论消除时间分别为8.00和911?d。

Xie等[12]2013年研究表明，50?mg/kg剂量下在全蛋中在停药后第10.5天，彻底检测不到阿莫西林。与该试验检测结果休药期（12.74?d）基本保存一致。该试验中阿莫西林在鸡蛋中的代谢曲线与文献[11-12]报道基本一致，均在停药后第1天左右达到药物浓度最高值。孙礼瑞等[13]在2015年研究报道的阿莫西林在鸡组织中的残留消除规律，结果是休药后第5天阿莫西林残留量低于最高残留限量（50?μg/kg）;该试验中鸡蛋样品在停药后第5天药物残留量为40.22?μg/kg，与文献报道基本一致。

迄今为止，国内外关于阿莫西林在鸡蛋中的残留研究极少，且多采用高效液相和质谱等的检测方法，但其前处理方法复杂，包含液液提取、固相萃取净化和衍生化等多步提取。该研究采用酶联免疫试剂盒，快速检测鸡蛋中的阿莫西林残留量，通过回收率和灵敏度验证，证明方法的科学性和可行性。开展2个不同厂家的阿莫西林在蛋鸡中的残留消除试验，试验结果与文献报道的消除曲线基本一致，且2个厂家的阿莫西林，在鸡蛋中的残留情况基本无差异。

该试验结果表明，蛋鸡在使用阿莫西林后，其在鸡蛋中休药期较长（12.74?d），且不同厂家的阿莫西林在鸡蛋中的休药期无差异，为临床提供相关的科学数据和快速检测的方法，防止兽医临床上的不合理使用，保障动物源性食品安全。

参考文献

[1]?谢恺舟，陈学森，徐东，等.高效液相色谱荧光检测法检测鸡蛋中阿莫西林残留[J].食品科学，2012，33（22）：264-268.

[2]?BOSI?P，MERIALDI?G，SCANDURRA?S，et?al.Feed?supplemented?with?3?different?antibiotics?improved?food?intake?and?decreased?the?activation?of?the?humoral?immune?response?in?healthy?weaned?pigs?but?had?differing?effects?on?intestinal?microbiota[J].?Journal?of?animal?science，2011，89：4043-4053.

[3]?吳永宁，邵兵，沈建忠.兽药残留检测与监控技术[M].北京：化学工业出版社，2007.

[4]?中华人民共和国农业部.动物性食品中兽药最高残留限量：公告第235号（附录4）[S].北京：中华人民共和国农业部，2002.

[5]?日本肯定列表制度.食品中农业化学品残留限量-?药品巻[M].北京：中国标准出版社，2006.

[6]?European?Union.Commission?Regulation（EU）No?37/2010of?22?December?2009?on?pharmacologically?active?substances?and?their?classification?regarding?maximum?residue?limits?in?food?stuffs?of?animal?origin[Z].2010.

[7]?沈建忠，钱传范，江海洋，等.马杜霉素在鸡组织中残留消除及临床毒性的研究[J].畜牧兽医学报，2000，31（5）：458-463.

[8]?INTORRE?L，CASTELLS?G，CRISTFOL?C，et?a1.Residue?depletion?of?thiamphenicol?in?the?seabass[J].J?Vet?Pharmacol?Therap，2002，25（1）：59-63.

[9]?WHITTEN?T.Pharmacokinetics?and?milk?discard?times?of?pirlimycin?after?intramammary?infusion：A?population?approach[J].J?Vet?Pharmacol?Therap，1999，22（1）：41-51.

[10]?CONCORDET?D，TOUTAIN?P?L.The?withdrawal?time?estimation?of?veterinary?drugs：A?nonparametric?approach[J].Joural?Vet?Pharmacol?Therap，1997，20（5）：374-379.

[11]?LIU?Y?N，PANG?M?D，XIE?X，et?al.Residue?depletion?of?amoxicillin?and?its?major?metabolites?in?eggs[J].Journal?of?veterinary?pharmacology?and?therapeutics，2017，40（4）：383-391.

[12]?XIE?K?Z，ZHAO?M，GUO?H?S，et?al.Determination?and?depletion?of?amoxicillin?residues?in?eggs[J].Food?additives?&?contaminants：Part?A，2013，30（4）：670-677.

[13]?孙礼瑞，谢星，张金玲，等.阿莫西林在鸡组织中的残留消除规律[J].中国兽医学报，2015，35（5）：767-773.

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