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106份水稻材料稻瘟病抗性鉴定及Pi9基因的分子检测

范文

陈晴晴夏加发张海珊张爱芳

摘要?采用苗期喷雾接种鉴定方法并利用Pi9基因的特异性分子标记检测，分析106份水稻材料的稻瘟病抗性水平及Pi9基因的分布情况。结果表明，106份水稻材料对供试菌株ZB-1、ZB-2、ZB-3、ZA-0、ZA-1、ZA-2的抗病率分别为94.3%、92.4%、92.4%、87.7%、59.4%、62.3%;27份水稻材料（占25.5%）含有Pi9基因，其对供试菌株ZB-1、ZB-2、ZB-3、ZA-0、ZA-1、ZA-2的抗病率分别为100%、100%、100%、96.3%、88.9%、92.6%。可见，Pi9基因在安徽省水稻抗病育种中具有一定应用价值。

关键词?稻瘟病;Pi9基因;抗性鉴定;分子检测

中图分类号?S435.111.4+1文献标识码?A文章编号?0517-6611（2020）07-0154-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.07.043

Evaluation?and?Distribution?of?the?Blast?Resistance?Gene?Pi9?of?106?Rice?Materials

CHEN?Qingqing1，?XIA?Jiafa2，?ZHANG?Haishan1?et?al

（1.Institute?of?Plant?Protection?and?Agricultural?Product?Quality?and?Safety，?Anhui?Academy?of?Agricultural?Sciences，?Hefei，Anhui??230031;2.Rice?Research?Institute，?Anhui?Academy?of?Agricultural?Sciences，?Hefei，Anhui??230031）

Abstract?106?rice?materials?were?assessed?for?blast?resistance?and?resistance?gene?Pi9?distribution?by?using?specific?molecular?markers.?The?results?showed?that?the?resistance?rates?of?106?rice?materials?to?the?tested?strains?ZB1，?ZB2，?ZB3，?ZA0，?ZA1?and?ZA2?were?94.3%，?92.4%，?92.4%，?87.7%，?59.4%?and?62.3%.?27?materials?（25.5%）?contained?the?resistance?gene?Pi9?and?the?resistance?rate?to?the?tested?strains?ZB1，?ZB2，?ZB3，?ZA0，?ZA1?and?ZA2?were?100%，?100%，?100%，?96.3%，?88.9%?and?92.6%.?It?can?be?seen?that?the?resistance?gene?Pi9?has?certain?application?value?in?rice?breeding?for?disease?resistance?in?Anhui?Province.

Key?words?Rice?blast;Pi9?gene;Resistance?identification;Molecular?detection

基金項目?安徽省科技重大专项（18030701175）。

作者简介?陈晴晴（1987—），女，安徽蚌埠人，研究实习员，从事水稻病害抗性鉴定与评价研究。通信作者，副研究员，从事水稻病害抗性鉴定与评价研究。

收稿日期?2019-12-10;修回日期?2020-01-10

稻瘟病是由稻梨孢属真菌[Magnaporthe?grisea（Hebert）Barr，无性态为Pyricularia?grisea（Cooke）Sacc.]引起的水稻三大病害之一，在全球水稻种植区均有发生，导致每年水稻产量损失10%～15%，损失达数十亿美元，严重危害水稻生产[1-3]。稻瘟病也是我国南北稻区危害最严重的病害之一，每年都有几个稻作区中等或偏重流行，且有增长趋势，因此如何防治和减少病害发生，对水稻生产具有重要意义[4-5]。

实践证明，选育和种植抗病水稻品种是防治稻瘟病最经济有效的途径，而发掘和利用水稻抗性遗传资源是水稻抗稻瘟病育种的基础[6]。近年来发展起来的分子标记技术可快速、准确鉴定出材料中所含的抗性基因类型，并利用与稻瘟病抗性基因紧密连锁的分子标记进行辅助选择，这对于培育抗稻瘟病水稻品种有重要意义[7]。

Pi9基因源自小粒野生稻，位于水稻6号染色体，是NBS-LRR类基因，是已克隆的抗稻瘟病主效基因之一，抗性比较广，对来自13个国家的43个稻瘟病菌株均表现出很高的抗性[8-10]。邹德堂等[11]研究表明Pi9基因在黑龙江省水稻抗病育种中具有很高应用价值，在黑龙江省乃至全国范围内加强对Pi9基因推广和应用意义重大。

笔者采用苗期喷雾接种鉴定方法对106份水稻材料进行稻瘟病抗性鉴定，并利用特异性分子标记检测方法对其Pi9基因的分布情况进行分析，以期明确Pi9基因在提高水稻抗病性方面的价值，为安徽省抗稻瘟病品种选育提供理论依据。

1?材料与方法

1.1?试验材料

1.1.1?水稻材料。106份供试水稻材料由安徽省农业科学院水稻研究所提供。单18（含Pi9基因）系作为阳性对照;丽江新团黑谷作为阴性对照。

1.1.2?供试菌株。供试菌株是笔者所在课题组在安徽省内采集并分离鉴定的6个菌株（ZB-1、ZB-2、ZB-3、ZA-0、ZA-1、ZA-2）。

1.2?试验方法

1.2.1?稻瘟病抗性鉴定。将供试菌株转接于PSA（马铃薯蔗糖琼脂粉）培养基上，在25～27?℃培养箱中培养5～7?d，待菌丝长满培养皿后，将长满菌丝的培养基切块移植到大麦粒培养基中，待稻瘟病菌产生大量孢子后，用无菌水清洗、过滤至烧杯中，配制孢子悬浮液（10×10倍光学显微镜每视野15～20个孢子）[12]。

供试材料经过浸种、催芽后，播种在育秧盘中，每份材料10～15粒。待秧苗3～4叶期时，用供试菌株孢子液喷雾接种。接种后置于25～28?℃温室内，并定时喷雾保湿。接种7?d后，参照国际统一标准调查发病情况：0级为高抗（HR），1～2级为抗（R），3级为中抗（MR），4～5级为中感（MS），6～7级为感（S），8～9级为高感（HS）[13-14]。

1.2.2?水稻DNA提取及PCR检测。使用新型植物基因组DNA提取试剂盒（DP320-02）提取水稻叶片基因组DNA，并保存于-20?℃备用。选用与Pi9基因紧密连锁的引物进行PCR扩增反应。引物序列由笔者所在课题组前人提供，Pi9-1F/R（5′—3′）：TGCCCAACCTTTACCCACTGTA/?AACATGAGTAGAAACAAATTAGTTTG，并由上海生工生物工程技术有限公司合成。PCR反应体系总体积20?μL，包括10?μL?2×SanTaq?PCR?Mix（含蓝染料），2?μL模板DNA，正、反向引物各1?μL，6?μL?ddH2O。PCR反應程序：94?℃预变性5?min;94?℃变性45?s，55?℃退火45?s，72?℃延伸1?min，34个循环;72?℃延伸10?min，4?℃保存。8?μL扩增产物，在1%琼脂糖凝胶上电泳，在凝胶成像系统中拍照[15-16]。

1.3?数据分析

根据水稻材料抗性水平调查结果计算其抗病率，抗病率=（高抗+抗+中抗）/总数×100%[17]。依据PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果，判断供试水稻材料中Pi9基因的有无。

2?结果与分析

2.1?水稻材料对稻瘟病的抗性表现

利用采自安徽的6个稻瘟病菌株分别接种供试水稻材料，结果见表1。由表1可知，106份水稻材料分别接种供试菌株ZB-1、ZB-2、ZB-3、ZA-0、ZA-1、ZA-2后，判断抗病材料分别有100份（94.3%）、98份（92.4%）、98份（92.4%）、93份（87.7%）、63份（59.4%）、66份（62.3%）。可知，供试水稻材料对安徽省稻瘟病菌ZB群的抗性表现较好。

根据抗性水平调查结果，106份水稻材料对所有供试菌株均表现抗病（0～3级）的材料有53份，占比50%。由此筛选出抗病材料，为安徽省水稻抗病育种提供材料。

2.2?Pi9基因的分子检测结果

利用Pi9基因的特异性分子标记对供试水稻材料进行检测，27份供试材料与单18（阳性对照）一样能在750～1?000?bp处扩增出1条特异条带，表明它们均含有Pi9基因;其余供试材料与丽江新团黑谷（阴性对照）一样，没有扩增出条带，表明不含Pi9基因（图1）。含有Pi9基因的材料占供试水稻材料的25.5%，说明Pi9基因在供试水稻材料中占比不高。

2.3?含Pi9基因的水稻材料对稻瘟病的抗性表现

由表2可知，27份含有Pi9基因的水稻材料对供试菌株ZB-1、ZB-2、ZB-3的抗性水平全部达到中抗及以上（抗病率为100%），对ZA-0、ZA-1、ZA-2的抗病率分别为96.3%、88.9%、92.6%。可知，含有Pi9基因的水稻材料抗病率明显较高。

3?结论与讨论

稻瘟病是水稻生产中最主要，也是最严重的病害之一，发病严重且易反复[18]。安徽省水稻生态环境多样，气候条件复杂，特别是江淮丘陵和皖西南山区，稻瘟病常年有不同程度发生，有的年份暴发成灾，损失严重。区试参试品种对稻瘟病的抗性表现整体不高[12]。另外，由于稻瘟病菌生理小种存在遗传复杂性、致病性多样性，生产中推广的种植品种3～5年就会丧失抗性。因此，挖掘抗性水平高的种质资源，对于提高稻瘟病抗性具有重要意义[19]。近年来，育种和植保工作者协同攻关，不断发掘稻瘟病抗源。阎勇等[20]从52份华南常用籼稻亲本中筛选获得广谱抗性材料4份，其中2份抗谱为100%，可利用这些抗源拓宽育种材料的遗传背景。该研究从106份水稻材料中获得53份抗病材料，其对所有供试菌株均表现中抗及以上，表明安徽省育种工作者可以对其利用研究。

目前，利用分子标记技术对水稻材料进行抗性基因检测，可以提高抗病基因鉴定及育种选择的效率[21-22]。Pi9基因是已报道的稻瘟病抗性主效基因之一，研究表明，Pi9基因对我国主要稻区稻瘟病病菌具有较好的抗性，在抗病育种中有很大利用价值[23-26]。该研究分析Pi9基因在水稻材料中的分布情况，筛选出27份含有Pi9基因的水稻材料，为今后育种工作中优良品种选育提供理论依据。结合抗病性鉴定结果，Pi9基因在安徽省抗病育种中具有较高的应用价值。

另外，考虑多个抗病基因综合应用，利用多个优良基因拓宽抗谱，是提高水稻品种抗性、减缓品种抗性丧失和培育具有持久抗性品种的途径[27-29]。该研究所获得的抗病材料中可能含有其他抗性基因，有待进一步发掘和利用。

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