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天门冬质量及RAPD遗传多样性研究

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徐昌艳罗忠圣曹旭林钱志瑶李相陵覃容贵

摘要?[目的]研究天門冬质量及RAPD遗传多样性，并探索其质量与RAPD遗传多样性间相关性。[方法]采用综合评分法，以总皂苷、多糖、浸出物含量为评价指标对天门冬进行质量评价;对天门冬RAPD反应体系进行优化，完成不同居群天门冬RAPD扩增，运用NTSYS?2.10e软件进行遗传多样性分析及UPGMA系统树图构建;分析天门冬质量与RAPD遗传多样性的相关性。[结果]18份天门冬样品质量差异较大;18份天门冬多态性百分率为89.62%，遗传相似系数为0.448?1～0.748?6，在阈值0.52处18份天门冬聚为两大类，其中贵州遵义桐梓天门冬单独分为一类，其余聚为一类。[结论]天门冬质量与RAPD遗传多样性无显著相关性，所建立的天门冬RAPD法可用于其遗传多样性研究，可为其良种选育、规范化种植奠定基础。

关键词?天门冬;质量评价;RAPD;遗传多样性;UPGMA

中图分类号?R282.71?文献标识码?A?文章编号?0517-6611（2021）03-0180-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.03.048

Abstract?[Objective]The?quality?and?RAPD?genetic?diversity?of?Asparagi?Radix?were?studied，?and?the?correlation?between?the?quality?and?RAPD?genetic?diversity?of?Asparagi?Radix?was?explored.?[Method]The?content?of?the?total?saponins，polysaccharide?and?alcoholsoluble?extract?in?Asparagi?Radix?was?taken?as?the?evaluation?index，?and?the?quality?of?Asparagi?Radix?was?evaluated?by?the?comprehensive?scoring?method.We?optimized?the?RAPD?reaction?system?of?Asparagi?Radix，?and?amplified?different?populations?of?Asparagi?Radix，based?on?the?RAPD?band?data，the?genetic?similarity?coefficients?were?analysed?by?NTSYS?2.10e，and?the?UPGMA?dendrogram?were?developed.The?correlation?between?the?genetic?diversity?of?RAPD?and?the?quality?of?Asparagi?Radix?was?analyzed.?[Result]The?quality?of?18?Asparagi?Radix?samples?was?very?different.The?polymorphism?rate?of?18?Asparagi?Radix?was?89.62%，and?the?genetic?similarity?coefficient?was?0.448?1-0.748?6.In?the?UPGMA?analysis，?under?the?threshold?of?0.52，?18?samples?were?divided?into?two?groups，1?sample?from?Zunyi?County?was?clustered?into?one?group，while?the?rest?of?the?17?samples?were?clustered?into?the?other?group.?[Conclusion]There?is?no?significant?correlation?between?the?quality?and?genetic?diversity?of?Asparagi?Radix.?The?established?RAPD?method?of?Asparagi?Radix?can?be?used?for?the?study?of?its?genetic?diversity，?which?can?lay?the?foundation?for?the?breeding?of?improved?varieties?and?standardized?planting?of?Asparagi?Radix.

Key?words?Asparagi?Radix;Quality?evaluation;RAPD;Genetic?diversity;UPGMA

天门冬（Asparagi?Radix）又名天冬，为《中国药典》（2015年版）收载品种[1]，不仅直接供中医临床配方使用，还作为“口炎清颗粒”“二冬膏”“石斛夜光丸”和“羚羊清肺颗粒”等多种中成药的主要原料，且天门冬中提取的天门冬甜素被广泛应用于食品领域。据《中华本草》记载：“贵州、云南、广西等地为天门冬主产区，其中贵州地区产量最大，品质最好”[2]。贵州地区天门冬主要分布于贵阳、余庆、凤岗、黔西、大方、息烽、天柱、独山、荔波、镇宁、福泉、龙里、榕江、兴义、黎平、沿河等地，遵义凤冈县有大面积种植[3]。项目组实地调查发现，贵州大方、龙里、息烽、兴义、遵义等地有野生天门冬分布，遵义凤冈县有栽培天门冬;广西桂林、玉林、南宁等地有野生天门冬分布，玉林、南宁等地有栽培天门冬;四川内江地区为文献记载的天门冬种植分布区，但调查发现由于天门冬生长周期长、产地加工方法复杂，该地区已少有农户种植;同属植物羊齿天门冬（A.filicinus?Buch.-Ham.ex?D.Don）、密齿天门冬（A.meioclados?Levl.，异名：小茎叶天冬）及西南天门冬（A.munitus?Wang?et?S.C.Chen）的块根在部分地区被误作天门冬入药;且《四川省中药材标准》收载的小天冬为密齿天门冬，在贵州省称为“壳天冬”[4]。项目组前期研究发现天门冬质量主要受其总皂苷含量影响，其次与其多糖和醇溶性浸出物相关[5]。

RAPD技术可以利用随机引物对物种基因组DNA进行多态性检测，操作简便、反应迅速、所需DNA量少，被广泛应用于药用植物遗传多样性研究。物种的遗传多样性决定其进化和适应环境的能力，种内遗传多样性越高，物种对环境变化的适应能力就越强[6]。因此，该研究收集了贵州、广西、云南等主产区的18份天门冬样品，以总皂苷、多糖、醇溶性浸出物含量为指标，采用综合评分法评价不同产地天门冬质量;优化建立天门冬RAPD的最佳反应体系，对不同产地天门冬进行RAPD遗传多样性和亲缘关系分析，并进行天门冬质量与RAPD遗传多样性的相关性分析，以期为天门冬种质资源筛选和良种选育提供参考。

1?材料与方法

1.1?材料

天门冬样品均为自采集，经贵州中医药大学魏升华教授鉴定为百合科植物天门冬[Asparagus?cochinchinensis（Lour.）Merr.]，样品剪取幼嫩叶片后再挖取块根，其中嫩叶片洗净，吸水纸吸干表面水分，置于封口袋中，于-20?℃低温保存;块根洗净，置恒温干燥箱50?℃烘干，并粉碎过60目筛，备用。样品产地详见表1。

DNAsecure?plan?tkit新型植物基因组提取试剂盒（DP320，北京TIANGEN生化科技有限公司）;琼脂糖（西班牙）;GoldView?Ⅰ型核酸染色剂、50×TAE缓冲液（北京索莱宝公司）;RAPD随机引物（上海捷瑞生物工程有限公司）。

1.2?不同产地天门冬质量评价

由于天门冬质量主要与其总皂苷、多糖和醇溶性浸出物含量相关，因此该研究根据前期研究建立的天门冬总皂苷、多糖含量测定方法[5]及《中国药典》（2015年版）中天门冬浸出物项下醇溶性浸出物含量测定方法进行测定，考虑到总皂苷、多糖、浸出物等成分对天门冬药材质量的影响程度，分别赋予总皂苷60%、多糖20%、醇溶性浸出物20%的权重，數据处理中引入综合指标“隶属度”，采用综合评分法评价天门冬质量，综合分=总皂苷隶属度×60%+多糖隶属度×20%+浸出物隶属度×20%，其中指标隶属度=（指标值-指标最小值）/（指标最大值-指标最小值），满分为1.00，计算得到综合评分越高，表示此地天门冬质量越好[7-8]。

1.3?天门冬RAPD遗传多样性研究

1.3.1?DNA提取与检测。

按试剂盒法进行天门冬基因组DNA提取，并采用琼脂糖凝胶电泳进行天门冬基因组DNA的完整性检测，然后采用多功能酶标仪进行天门冬基因组DNA浓度及纯度检测。

1.3.2?RAPD反应体系优化。

经文献查阅及预试验，确定天门冬RAPD初始反应体系，再对天门冬RAPD-PCR扩增中影响较大的因素（DNA模板浓度、引物浓度、2×Taq?PCR?MasterMix浓度）进行优化，每次改变1个因素时其他条件不变，最终确定天门冬RAPD最优反应体系。扩增程序：95?℃预变性5?min;94?℃变性60?s，再50?℃退火70?s，然后72?℃延伸1.5?min，40次循环;最后72?℃延伸10?min;得到的产物于1.6%琼脂糖凝胶中进行电泳分离（100?V电压），1?h后从电泳槽中取出，在凝胶成像系统中进行显像观察并记录拍照[9]。

1.3.3?引物筛选。

分别采用60条RAPD随机引物（含10个碱基的寡核苷酸）进行天门冬基因组DNA的RAPD扩增，优选出扩增条带清晰、稳定性好的引物作为天门冬RAPD扩增有效引物。

1.3.4?不同产地天门冬RAPD扩增。

以RAPD优化体系和有效引物分别对18份不同产地天门冬进行PCR扩增，采用人工读取方式进行条带统计，并计算条带多态性百分率（PPB），采用NTSYS?2.10e软件获得不同产地天门冬遗传相似性系数矩阵，并采用非加权配对算术平均法（UPGMA）进行聚类分析，构建不同产地天门冬的亲缘关系。

2?结果与分析

2.1?不同产地天门冬质量评价

以天门冬总皂苷、多糖、醇溶性浸出物含量为评价指标，引入“隶属度”进行综合评价不同产地天门冬质量，综合评分见表1。由表1可知，不同产地18份天门冬综合评分为0.168?4～0.915?0，其中以S9（贵州开阳龙岗镇2）综合评分最高，为0.915?0，其次是S13（云南昆明2），综合评分为0.788?8，S16（贵州省贵安新区黨武镇）综合评分最低，为0.168?4。表明18份不同产地天门冬质量差异较大，其中贵州开阳龙岗镇2产的天门冬质量最好，其次是云南昆明2，而贵州贵安新区党武镇产的天门冬质量最差。

2.2?天门冬RAPD遗传多样性研究

2.2.1?基因组DNA提取与检测。

由图1可见，18份不同产地天门冬的基因组DNA电泳条带清晰;且天门冬OD260/280值为1.70～1.87，浓度为234.9～253.0?μg/mL，表明提取的天门冬DNA纯度高、质量好，可用于后续RAPD扩增。

2.2.2?RAPD反应体系优化。

由图2可见，根据扩增条带清晰度、数量、明亮程度对比，选择条带清晰、数量多、明亮的条带，优选出25?μL天门冬RAPD反应体系中DNA模板最适用量应为48?ng，引物最适用量应为1.2?μmol，2×Taq?PCR?MasterMix最适用量应为10.5?μL，ddH2O补足。

2.2.3?引物筛选。

从60条RAPD随机引物中筛选出的20条有效引物进行RAPD扩增，扩增效果见图3，20条有效引物共扩增出164条清晰的多态性条带，其PPB为89.62%，扩增产物的片段大小为100～2?000?bp，平均每条引物扩增出9条条带，每条有效引物的PPB为77.78%～100.00%，表明天门冬有丰富的多态性。

2.2.4?不同产地天门冬RAPD扩增产物的多态性分析。

18份不同产地天门冬样品经RAPD扩增出的多态性位点数及PPB结果见表1。其中S5（广西南宁长岗村）天门冬的PPB?最低，为42.08%，S15（云南昆明4）天门冬的PPB?最高，为68.31%，贵州天门冬的PPB?平均为53.34%，根据多态性百分率就可以看出广西南宁长岗村的天门冬适应环境的能力稍弱，云南昆明4的天门冬适应环境的能力相对较强。

2.2.5?不同产地天门冬的相似性及聚类分析。

18份不同产地天门冬通过NTSYS?2.10e软件进行遗传相似性分析，遗传相似系数矩阵结果见表2。由表2可知，不同产地天门冬的RAPD遗传相似系数为0.448?1～0.748?6，说明不同产地天门冬之间存在丰富的遗传变异。其中S8（贵州开阳龙岗1）样品与S9（贵州开阳龙岗2）样品的遗传相似性系数最大，为0.748?6，表明两者的亲缘关系最近;S11（贵州开阳龙岗4）样品和S18（贵州遵义桐梓）样品的遗传相似性系数最小，为0.448?1，表明两者的亲缘关系最远。

根据18份不同产地天门冬的遗传相似系数进行UPGMA系统树图构建，结果见图4。在阈值0.52时，不同产地天门冬聚为两大类，其中S18单独分为第Ⅰ类，其余产地天门冬聚为第Ⅱ类，表明贵州遵义桐梓天门冬与其他产地天门冬间的亲缘关系较远，其间存在一定程度的遗传变异;其中第Ⅱ类在阈值为0.54时又可分为2类，第Ⅰ类包括S1（贵州贵阳新场1）、S4（贵州贵阳新场4）、S5（广西南宁长岗村）、S7（贵州修文六中）、S8（贵州开阳龙岗1）、S9（贵州开阳龙岗2）、S13（云南昆明2）、S15（云南昆明4）、S16（贵州贵安新区党武）、S17（贵州关岭），其余产地为第Ⅱ类。

2.3?天门冬质量与RAPD遗传多态性的相关性分析

利用SPSS?20.0软件，采用双变量相关性法对天门冬质量与RAPD遗传多样性多态性百分率（PPB）的相关性进行分析，结果发现（图5），天门冬总皂苷含量与RAPD遗传多样性的相关系数为0.125，对应的显著性为0.622，在0.05水平上不存在显著相关性;天门冬多糖含量与RAPD遗传多样性的相关系数为0.338，对应的显著性为0.170，在0.05水平上不存在显著相关性;天门冬醇溶性浸出物含量与RAPD遗传多样性的相关系数为-0.004，对应的显著性为0.998，在0.05水平上不存在显著相关性;天门冬质量综合评分与其RAPD遗传多样性的相关系数为0.202，对应的显著性为0.422，在0.05水平上不存在显著相关性。因此，初步推断天门冬质量与RAPD遗传多态性无显著相关性，质量好的天门冬对环境的适应能力未必强。

3?讨论与结论

由于进行权重的综合评分法中权重具有主观随意性，易导致评价结果的不确定性，因此该试验以总皂苷、多糖、醇溶性浸出物含量为评价指标，引入综合指标“隶属度”，再综合评分进行18份不同产地天门冬的质量评价，此评价方法更严谨，评价结果更可靠[7]。18份不同产地天门冬中，贵州开阳龙岗镇2产的天门冬评分最高，即质量最好，其次是云南昆明2，而贵州贵安新区党武镇产天门冬质量最差，究其原因可能是贵州贵安新区党武采集地为山坡，土层较薄，具体原因有待进一步研究确定。

高质量的植物基因组DNA是DNA分子标记鉴定的前提，前期研究中分别采用CTAB法和新型植物基因组DNA提取试剂盒法，对天门冬药材和幼嫩叶片的基因组DNA提取效果进行比较，发现由于天门冬药材药用部位为块根，其组织可能受烘干或日晒、产地加工等影响，使得天门冬药材基因组DNA提取难度大[10-12]。

该试验中发现影响天门冬RAPD-PCR扩增的主要因素是模板DNA、引物及Mg2+、Taq?DNA聚合酶和dNTPs浓度，其中模板DNA浓度过低，分子发生碰撞概率小，PCR扩增产物将无或少;而DNA模板的浓度太大，扩增产量过大，条带数过多，将难以分离，不利于后续条带读取;其次引物浓度过低，将直接影响PCR的产率，可能出现无扩增条带的现象。该试验所用2×Taq?PCR?MasterMix中包括Mg2+、Taq?DNA聚合酶和dNTPs，其浓度直接影响RAPD稳定性和多态性[13]。因此，该试验分别考察了模板DNA、引物及2×Taq?PCR?MasterMix的浓度对天门冬RAPD扩增的影响，建立了天门冬RAPD-PCR扩增的最优反应体系。

植物种间或种内个体间遗传相似系数越大，表明亲缘关系越近，遗传差异越小;遗传相似系数越小，则亲缘关系越远，遗传差异越大[13-15]。不同产地18份天门冬的RAPD遗传相似系数为0.448?1～0.748?6，部分贵州不同产地间的天门冬遗传相似系数小，其间亲缘关系远，而贵州部分地区与云南昆明的天门冬样品间遗传相似系数大，其间亲缘关系近;广西南宁与云南昆明部分天门冬样品间遗传相似系数大，其间亲缘关系近。并经UPGMA聚类分析，发现S18样品单独分为一类，其余样品聚为一类;在阈值为0.54处时，S1、S4、S5、S7、S8、S9、S13、S15、S16、S17样品聚为一类，其他7份样品聚为一类，结果表明，不同居群天门冬之间存在丰富的遗传多样性，天门冬对环境的适应能力很强;且遗传相似系数和聚类分析的结果与样品来源的地理距离并不存在一致性，可能与样品来源地的地形、气候等自然因素有关。

参考文献

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