标题 | 荭草提取物对大鼠CYP450酶的抑制作用评价 |
范文 | 吕婷 潘洁 陆苑 孙佳 刘春花 李勇军 王永林 摘要 [目的]考察荭草提取物对大鼠肝微粒体CYP450中6种亚型酶的体外抑制作用,从而预测发生药物相互作用的可能性,为临床合理用药提供科学依据。[方法]在肝微粒体孵育体系中,将荭草提取物分别与混合探针底物(非那西丁/CYP1A2、氯唑沙宗/CYP2E1、右美沙芬/CYP2D4、奥美拉唑/CYP2C19、甲苯磺丁脲/CYP2C11、睾酮/CYP3A2)共同孵育,UPLC-MS/MS 检测各探针底物的代谢物生成量,采用GraphPad v5.0 软件计算半数抑制浓度(IC50)。[结果]荭草提取物对大鼠肝微粒体中 CYP1A2、CYP2E1、CYP2D4、CYP2C19、CYP2C11 和CYP3A2的IC50值在85.75~345.00 μg/mL。[结论]在临床剂量下,荭草提取物对大鼠肝微粒体CYP2C19、CYP2D4有弱抑制作用,对CYP1A2有强抑制作用。 关键词 荭草提取物;细胞色素P450酶;抑制作用;药物相互作用 中图分类号 R285.5文献标识码 A文章编号 0517-6611(2021)02-0162-03 doi:10.3969/j.issn.0517-6611.2021.02.044 开放科学(资源服务)标识码(OSID): Evaluation of the Inhibitory Effect of Polygonum orientale L. Extract on CYP450 Enzymes in Rats L Ting1,2, PAN Jie1, LU Yuan1 et al (1.State Key Laboratory of Functions and Applications of Medicinal Plants, Guizhou Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics, Guizhou Medical University, Guiyang, Guizhou 550004;2. School of Pharmacy,Guizhou Medical University, Guiyang, Guizhou 550004) Abstract [Objective]To investigate in vitro inhibition effect of Polygonum orientale extract on six subtypes of enzyme in rat liver microsomal CYP450, to predict the possibility of drug interactions, and provide scientific basis for clinical rational drug use. [Method]In the liver microsome incubation system, the Polygonum orientale extract was mixed with the probe substrates (phenacetin/CYP1A2, chlorzoxazone/CYP2E1, dextromethorphan/CYP2D4, omeprazole/CYP2C19, tolbutamide/CYP2C11, testosterone/CYP3A2) were incubated together.The quantitation of metabolites of substrates was achieved by UPLCMS/MS,the IC50 values were calculated by GraphPad v5. 0 software.[Result]The IC50 values of Polygonum orientale extract on CYP1A2,CYP2E1,CYP2D4,CYP2C19,CYP2C11 and CYP3A2 of rat liver microsomes were in the range of 85.75-345.00 μg/mL. [Conclusion] In clinical doses, Polygonum orientale extract have weak inhibitory effect on rat liver microsomal CYP 2C19 and CYP 2D4, have strong inhibition on CYP1A2. Key words Polygonum orientale L. extract;Cytochrome P450 enzymes;Inhibition;Drug interaction 葒草为蓼科植物荭草(Polygonum orientale L.)的干燥果穗及带叶茎枝,在贵州省分布广泛,在该省民间常用于胸痛、胸闷、气短、中风偏瘫(嘴角歪斜)等疾病的治疗[1],具有潜在的药用开发价值。许多学者对荭草药材的药用部位筛选[2]、化学成分[3-5]、指纹图谱[6]、质量标准[7]、提取工艺[8]等关键技术进行了研究。目前已研制开发了2个中药新药:注射液复方荭草冻干粉针[9]、荭叶心通软胶囊[10],用于治疗冠心病与心绞痛。 该试验采用Cocktail探针药物法,选择较为典型的6种探针药物(非那西丁、奥美拉唑、甲苯磺丁脲、右美沙芬、氯唑沙宗、睾酮分别作为CYP1A2、CYP2C11、CYP2C19、CYP2D4、CYP2E1、CYP3A2)所对应的特异性底物[11-12],测定荭草提取物对大鼠肝微粒体中CP450酶活性的影响,预测与其他药物联合应用是否存在潜在的代谢性药物相互作用,为荭草临床合理用药提供科学依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 仪器。 ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQ-S超高效液相色谱-三重四级杆质谱串联仪(美国Waters);Varioskan Lux 多功能酶标仪(美国ThermoFisher);Beckman Coulter Optima XPN-100智能型超速离心机(美国Beckman);Forma 905-ULTS1490 医用低温冰箱(美国Thermo Fisher);ST40R 台式大容量冷冻离心机(美国ThermoFisher);Allegra64R台式冷冻离心机(美国Beckman);IMS-70雪花制冰机(普瑞赛斯仪器);DK-8D电热恒温水槽(普瑞赛斯仪器);KQ-300DE超声波清洗器(贵州中润四通科技有限公司);VX-Ⅲ多管涡旋振荡器(藤锦(北京)医药科技有限公司);XYN-15LP氮吹仪氮气发生器(上海析友分析仪器有限公司)。 1.1.2 试药。 荭草药材,购自贵州省盘州市,由贵州医科大学药学院药用植物学与生药学教研室刘春花副教授鉴定;右美沙芬,批号为090M1298V,購于美国 Sigma 公司;奥美拉唑、甲苯磺丁脲、氯唑沙宗,批号分别为J0508A、J1010A、J1115A,购于美伦生物;睾酮,批号L31J8T40939,购于源叶生物;对乙酰氨基酚,批号为B14A9E58584,购于源叶生物;右啡烷,批号JC0496-201706111,购于上海健超生物科技有限公司;羟基甲苯磺丁脲(批号S002875)、5-羟基奥美拉唑(批号FS1607320)、6-羟基氯唑沙宗(批号FS16070322)和 6β-羟基睾酮(批号ALT701407),购于美国A ChemTek公司;NADPH,批号704S022,购于美国索莱宝;乙腈购于德国默克试剂公司;其他无机盐均为分析纯;甲醇为色谱纯。 1.1.3 实验动物。 SD大鼠,雄性,180~220 g,SPF级,由重庆腾鑫生物技术有限公司提供(动物许可证号SCXK(渝)2012-0008)。 1.2 方法 1.2.1 荭草提取物的制备。 取荭草药材10 kg,分别用10倍水煮3次,每次1 h,过滤,合并滤液,滤液浓缩至1 g/mL;缓慢加入乙醇使溶液含醇量达65%,继续搅拌30 min,静置12 h,抽滤,滤液浓缩至1 g/mL;以1/2倍水饱和正丁醇萃取4次,合并正丁醇相,减压回收正丁醇;正丁醇提取物加80%乙醇溶解,上聚酰胺柱,用8倍柱体积的80%乙醇洗脱,收集洗脱液,减压回收乙醇,残留物微波真空干燥,得荭草提取物,收膏率为5.02%。 1.2.2 大鼠肝微粒体的制备。 大鼠禁食一夜,股动脉取血处死。取肝脏,生理盐水灌注至土黄色,1.15% KCl溶液洗涤3次,滤纸吸干称重。剪碎,加3倍体积的EDTA匀浆液,冰浴中匀浆。4 ℃,1 072 r/min离心10 min,取上清,纱布过滤取上清;4 ℃,4 290 r/min离心20 min,纱布过滤取上清;4 ℃,35 320 r/min离心45 min,弃上清。沉淀加入20%甘油重悬液,吹散均匀,BCA试剂盒测定蛋白浓度,分装,-20 ℃下预存60 min,转移至-80 ℃保存。 1.2.3 溶液的配制。 1.2.3.1 混合探针的配制。 分别精密称取非那西丁、奥美拉唑、甲苯磺丁脲、右美沙芬、氯唑沙宗和睾酮约10 mg,甲醇定容至10 mL,得浓度依次为1.070、1.033、1.043、1.042、1.004、1.049 mg/mL,作为储备液。临用前,精密吸取非那西丁贮备液24 μL、奥美拉唑贮备液12 μL、甲苯磺丁脲贮备液396 μL、右美沙芬贮备液18 μL、氯唑沙宗贮备液385 μL和睾酮贮备液21 μL于10 mL EP管中,氮气吹干,加入30 μL DMSO溶解混合底物,然后用 PBS 缓冲溶液(pH 7.4)定容至6 mL,37 ℃ 预热待用。此时,非那西丁、奥美拉唑、甲苯磺丁脲、右美沙芬、氯唑沙宗和睾酮的浓度分别为 10.0、2.5、100.0、5.0、150.0、5.0 μmol/L。 1.2.3.2 探针代谢物对照品溶液的配制。 称取适量对乙酰氨基酚、5-羟基奥美拉唑、羟基甲苯磺丁脲、右啡烷、6-羟基氯唑沙宗和6β-羟基睾酮分别溶于甲醇,所得浓度分别为100.2、100.0、98.8、100.0、101.4、102.9 μg/mL,作为储备液。 1.2.3.3 特异性抑制剂的配制。 精密称取适量α-萘黄酮、噻氯匹定、氟康唑、奎尼丁、氯美噻唑和酮康唑,加入适量甲醇,超声3 min,放冷至室温,再定容得浓度分别为1.023mg/mL(α-萘黄酮)、1.079 mg/mL(噻氯匹定)、1.099 mg/mL(氟康唑)、1.021 mg/mL(奎尼丁)、1.452 mg/mL(氯美噻唑)、1.005 mg/mL(酮康唑)的储备液,-20 ℃下储存,临用前用PBS缓冲液稀释至所需浓度。 1.2.4 孵育体系与样品前处理。 将50 μL肝微粒体蛋白(终浓度为1 mg/mL)、50 μL 荭草提取物/特异性抑制剂(用PBS稀释至不同浓度)、80 μL混合探针药物(CYP1A2、CYP2C11、CYP2C19、CYP2D4、CYP2E1、CYP3A2的底物非那西丁、奥美拉唑、甲苯磺丁脲、右美沙芬、氯唑沙宗、睾酮终浓度分别为10.0、2.5、100.0、5.0、150.0、5.0 μmol/mL)在37 ℃下水浴预孵育5 min,加入20 μL NADPH(终浓度1 mmol/L)启动反应(该反应体系有机溶剂体积分数小于1%)。反应结束,加入 200 μL 冰甲醇终止反应,再加入200 μL 冰内标溶液,涡旋混合1 min,超声3 min,15 000 r/min 离心10 min,取上清液,用于UPLC-MS/MS 定量分析。 1.2.5 UPLC-MSMS分析条件。 1.2.5.1 UPLC色谱条件。 色谱柱采用Waters BEH C18柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm),保护柱采用Waters Van Guard BEH C18(2.1 mm×5 mm,1.7 μm),流速为0.35 mL/min,柱温为40 ℃,进样体积为2 μL,流动相为0.1%甲酸乙腈(A)与0.1%甲酸水溶液(B),梯度洗脱条件为0 ~3.0 min,10%~65% A;3.0~3.5 min,65%~90% A;3.5~4.5 min,10% A。 1.2.5.2 MS质谱条件。 电喷雾电离源(ESI);毛细管电压:3 kV;离子源温度:120 ℃;去溶剂气温度:600 ℃;去溶剂气:N2,流速1 000 L/h;反吹气:N2,流速50 L/h;碰撞气:Ar,流速0.16 mL/min;质谱数据采集及处理软件为MassLynx V 4.1工作站,扫描方式为多反应离子监测模式(MRM),条件见表1。 2 结果与分析 2.1 混合特異性抑制剂对大鼠肝微粒体中CYP450酶6个亚型的抑制作用 为了验证体外微粒体孵育体系可行性,分别选取6个亚型的特异性抑制剂CYP1A2(α-萘黄酮)、CYP2E1(氯美噻唑)、CYP2D4(奎尼丁)、CYP2C19(噻氯匹定)、CYP2C11(氟康唑)、CYP3A2(酮康唑),取大鼠肝微粒体,按“1.2.3.3”方法操作,将抑制剂与探针底物共同孵育,测定代谢产物。通过Graph Pad Prime 5.0软件拟合曲线并计算IC50值。结果发现(表2),特异性抑制剂IC50均在文献报道[13-14]范围内,提示该孵育体系方法合理可行。 2.2 荭草提取物对大鼠肝微粒体中CYP450酶6个亚型的抑制作用 用PBS将荭草提取物稀释至8个浓度,使其加入孵育体系后的最终浓度分别为0.064、0.032、1.600、8.000、40.000、200.000、1 000.000、5 000.000 μg/mL,按“1.2.3.3”方法操作,将荭草提取物与探针底物共同孵育,每个浓度平行操作5次,测定代谢产物。以空白组的代谢物生成量为V0,探针代谢物生成量为Vc,剩余酶活性I=Vc/V0×100%,以剩余酶活性为纵坐标、荭草提取物的浓度为横坐标,通过Graph Pad Prime 5.0软件拟合曲线并计算IC50值。结果如图1和表3所示,在临床剂量下,荭草提取物对大鼠肝微粒体CYP2C19、CYP2D4有弱抑制作用,对CYP1A2有强抑制作用。荭草提取物对大鼠肝微粒体中CYP1A2、CYP2E1、CYP2D4、CYP2C19、CYP2C11 和CYP3A2的 IC50值在85.75~345.00 μg/mL。 3 讨论与结论 该试验使用UPLC-MS/MS建立了同时测定大鼠肝微粒体孵育体系中Cocktail混合探针药物对应代谢产物(CYP3A2-睾酮/6β-羟基睾酮、CYP2C11-甲苯磺丁脲/羟基甲苯磺丁脲、CYP2C19-奥美拉唑/5-羟基奥美拉唑、CYP2D4-右美沙芬/右啡烷、CYP2E1-氯唑沙宗/6-羟基氯唑沙宗、CYP1A2-非那西丁/对乙酰氨基酚)的方法,该方法可特异、快速、准确、灵敏地测定孵育体系中的6个代谢产物。 试验中,按“1.2.3.3”方法操作,考察不同大鼠肝微粒体浓度(0、0.10、0.25、0.50、0.75、1.00、1.50 mg/mL)和不同孵育时间(0、5、10、15、30、45、60、90 min)与代谢物生成量的线性关系,结果显示6种代谢产物的最佳蛋白浓度为1 mg/mL,最佳孵育时间为30 min。因此,试验中选用1 mg/mL 的肝微粒体作为试验对象,孵育时间为30 min。 假设药物全部吸收经过肝脏代谢。临床上,荭草有关制剂一次口服剂量转化成生药量为9~15 g/次,根据水提取物的转化率(5.02%),9~15 g生药相当于提取物0.45~0.75 g,以大鼠平均肝重、制得的平均微粒体重计算大鼠的给药剂量为102.0~164.4 μg/mL。因此,荭草提取物对CYP2C19、CYP2D4有弱抑制作用,对CYP1A2有较强的抑制作用。前期研究表明,荭草提取物的主要成分为原儿茶酸、异荭草素、荭草素、牡荆素等酚酸类和黄酮类化合物[4],在黄芩水提物对大鼠肝微粒体抑制作用的研究[15]中表明,黄酮类化合物对肝微粒体P450酶的亚型1A有强抑制作用,而荭草提取物作为黄酮类成分含量较多的水提物,对CYP1A2有强抑制作用。 综上所述,临床上使用荭草作为主要治疗药物或者辅助治疗药物时,要考虑到其对CYP2C19、CYP2D4的弱抑制作用以及对CYP1A2的强抑制作用,以避免用药过程中对药物的代谢产生抑制。 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