| 标题 | 中温乳化肠中凝结芽孢杆菌芽孢萌发及热致死规律 |
| 范文 | 摘 要：从中温乳化香肠中筛选出一株凝结芽孢杆菌芽孢，以20 种氨基酸、D-果糖、D-葡萄糖、氯化钾为萌发剂，通过相差显微镜及生长曲线测定仪测定600 nm波长下光密度值，研究该芽孢萌发规律，同时研究7 种防腐剂对芽孢萌发效果影响及不同温度热胁迫处理后的芽孢致死率。结果表明：葡萄糖可以促进凝结芽孢杆菌芽孢萌发，增大其浓度对芽孢萌发率无影响；绘制了芽孢萌发率标准曲线，相关系数为0.977 8；亚硝酸钠、山梨酸钾、乳酸链球菌素（nisin）和脱氢乙酸钠对芽孢萌发无影响，乳酸钠、葡萄糖酸-δ-内酯和双乙酸钠可以抑制芽孢萌发；采用90 ℃及95 ℃对芽孢热胁迫致死效果较差，100 ℃热处理最高致死率可达92.09%，105～120 ℃热胁迫处理对该芽孢致死率在15 min内可以接近100%。 关键词：凝结芽孢杆菌芽孢；芽孢萌发；生长规律；热胁迫；致死率；防腐剂 Abstract： The spore germination of a Bacillus coagulans stain isolated from medium-temperature sterilized emulsified sausage was investigated using 20 amino acids， D-fructose， D-glucose and potassium chloride as germination inducers by phase contrast microscopic morphology observation and measurement of optical density （OD） values at 600 nm with a Bioscreen growth analyzer. Also， we examined the effect of seven preservatives on spore germination and we evaluated spore inactivation after heat treatment at different temperatures. Results showed that glucose could promote the germination of Bacillus coagulans spore， and the spore germination percentage did not changed with increasing glucose concentration. A standard curve with a correlation coefficient of 0.977 8 was established to determine the spore germination percentage. Sodium nitrite， potassium sorbate， nisin and dehydrogenation sodium acetate had no effects on spore germination， whereas sodium lactate， glucose acid-δ-lactone and sodium acetate could inhibit spore germination. When treated at 100 ℃， the inactivation percentage was up to 92.09%， and at 105–120 ℃， the value was almost 100% within 15 min； however， the spores were not effectively inactivated at 90 and 95 ℃. Key words： Bacillus coagulans spore； spore germination； growth pattern； heat stress； inactivation percentage； preservative DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201704003 中图分类号：TS251.1 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2017）04-0010-07 引文格式： 李素， 張顺亮， 潘晓倩， 等. 中温乳化肠中凝结芽孢杆菌芽孢萌发及热致死规律[J]. 肉类研究， 2017， 31（4）： 10-16. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201704003. http：//www.rlyj.pub LI Su， ZHANG Shunliang， PAN Xiaoqian， et al. Spore germination and thermal inactivation of a Bacillus coagulans strain isolated from medium-temperature sterilized emulsified sausage[J]. Meat Research， 2017， 31（4）： 10-16. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201704003. http：//www.rlyj.pub 凝结芽孢杆菌是一种可以产生乳酸的芽孢杆菌，它同时具有芽孢杆菌及乳酸菌的特性，还具有调节动物肠道健康、提高免疫力等特点，因此凝结芽孢杆菌在饲料中的应用研究逐渐增加[1]。但是，在肉制品加工与保藏过程中凝结芽孢杆菌的大量繁殖则会导致产品腐败变质。随着人们对肉制品食用品质需求的提高，中温肉制品逐渐成为肉制品市场的焦点，中温肉制品是指在一定压力下，经过90～110 ℃杀菌，结合综合抑菌和品质控制技术生产的肉制品[2]。中温杀菌过程中大部分微生物会被杀死，但细菌的芽孢及部分耐热菌等仍能存活下来，逐渐生长为中温肉制品的腐败菌[3]。系列研究发现，众多真空包装低温肉制品中主要腐败菌为乳酸菌，包括乳杆菌属（Lactobacillus）、明串珠菌属（Leuconostoc）等[4-8]。 芽孢杆菌的芽孢可以长时间保持休眠状态，一旦遇到适宜的环境，芽孢即可迅速萌发成为具有代谢功能的营养细胞，从而降低对外界刺激的耐受力[9-10]。芽孢可以通过多种刺激因素诱导萌发，包括糖、氨基酸等营养刺激萌发，也可以通过物理刺激如加热、高压等刺激诱导部分芽孢萌发等[11-12]。防腐剂常用于肉制品加工中，具有显著的抑菌保鮮作用，防腐剂对细菌营养体抑制作用研究较多，但其对芽孢萌发及生长特性的研究较少，国外也仅有少数关于耐热芽孢杆菌及梭状芽胞杆菌等有限菌株的芽孢的报道[13-16]，而国内相关研究更是空白，仅有少数学者研究抑菌剂对芽孢的耐热性影响[17]。目前认为，微生物会呈现死亡、受损和未受损3 种状态，受损细胞通常又被称为亚致死细胞，细胞受损后在适宜的环境下又可以恢复其活力，从而影响食品保藏品质[18]。对于细菌亚致死损伤的研究多集中于大肠埃希氏菌、沙门氏菌、单增李斯特菌等食源性病菌[19-20]，对于芽孢杆菌的亚致死损伤鲜有报道。 凝结芽孢杆菌是一种特殊的乳酸菌，多数研究将其作为有益菌进行研究[21-22]，而在中温乳化香肠贮藏中则是主要腐败菌，它形成的芽孢具有良好耐热性，对于凝结芽孢杆菌芽孢营养萌发特性还未见报道，国外也仅有少数关于温度及高压处理对凝结芽孢杆菌芽孢灭活动力学的研 究[23-26]。本实验以前期从中温乳化香肠中筛选的凝结芽孢杆菌芽孢为研究对象，分析营养剂和抑菌剂对其萌发特性的影响及热胁迫下的致死率，结合促芽孢萌发技术及其热胁迫下的生长规律，研究该腐败菌的快速萌发杀灭技术，以期为中温肉制品生产提供有效的腐败微生物控制技术，为中温肉制品加工条件的控制和保鲜技术提供参考。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 凝结芽孢杆菌CMRC BC-1 由本实验室人员从中温乳化香肠筛分后鉴定保藏[27]；D-葡萄糖（D-glucose）（记为G）、D-果糖（D-fructose）（记为F）、氯化钾（KCl）（记为K）、MnSO4·H2O、氨基酸 北京化学试剂厂；营养琼脂（nutrient agar，NA）培养基、MRS肉汤培养基、平板计数培养基 北京陆桥技术有限责任 公司；乳酸链球菌素（nisin）、亚硝酸钠、乳酸钠 北京迪朗生化科技有限公司；山梨酸钾、脱氢乙 酸钠 南通奥凯生物技术开发有限公司；葡萄糖酸-δ-内酯 安徽省兴宙医药食品有限公司；双乙酸钠 连云港信仁食品添加剂有限公司。 1.2 仪器与设备 Bioscreen全自动生长曲线分析仪 上海谓载商贸发展有限公司；生物安全柜 新加坡Esco公司；Primo Star生物显微镜配备DDC数显通道 德国蔡司公司；G154DWS湿热灭菌锅 日本三洋公司；KB720培养箱 德国Binder公司；DF-101S磁力搅拌恒温油浴锅 上海力辰科技有限公司。 1.3 方法 1.3.1 芽孢培养与制备收集 参考文献[28]中方法并进行适当调整。将保藏的凝结芽孢杆菌经液体培养基活化后接种于营养琼脂培养基，培养基中加入0.05 mol/L的MnSO4·H2O以促进芽孢生成。将接菌的平板于40 ℃条件下培养至有90%以上芽孢释放后收集，一般为4～6 d。用无菌水将形成的芽孢菌体收集后在80 ℃条件下加热30 min以杀灭营养体，将收集的菌悬液用无菌水在6 000×g、4 ℃条件下离心4～8 次，每次15 min，以洗去大部分营养体细胞，离心完成后用少量无菌水重新制成芽孢悬液，使用相差显微镜观察细菌芽孢、营养体及其碎片。调整芽孢悬液浓度至1010 CFU/mL，4 ℃保存备用。 1.3.2 芽孢营养萌发处理及萌发率测定 取制备好的芽孢悬液适当稀释，充分振荡后等量分装于离心管中，6 000×g离心3 min，去掉上清液，然后分别加入等体积的50 mmol/L的G、F、K及20 种氨基酸的营养液，营养液采用无菌水配制，使用前经0.45 μm无菌滤膜过滤，对照组加入灭菌水，充分振荡。将新制的芽孢悬液分为2 份，1份在40 ℃培养箱培养，并在相差显微镜下观察其萌发情况，每20 min镜检1 次，确定其萌发情况，镜检时每个条件制取3 个玻片进行观测，每个玻片上取四角及中心5 个点；另1份同时采用生长曲线测定仪在40 ℃条件下监测其在600 nm波长处的光密度（optical delnsity，OD）值变化，OD值每5 min测定1 次，每个点取5 个平行，各数值取平均值，根据镜检结果计数萌发率并通过与OD值的降低比率的关系绘制芽孢萌发标准曲线。芽孢镜检萌发率计算见式（1），OD值降低比率计算见式（2）。 1.3.3 防腐剂对芽孢抑制作用的处理方法 根据国标GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》[30]中防腐剂的使用限量规定，实验采用肉制品中使用的最高添加质量浓度，测定不同防腐剂对芽孢萌发情况的影响，将稀释到适宜浓度的芽孢悬液等体积分装于不同管中，实验组分别加入相同量的萌发剂与1 种防腐剂混合液，对照组只添加萌发剂，每管溶剂总添加量相同，通过在40 ℃条件下培养观察OD值变化确定其对芽孢萌发效果影响。防腐剂配制：称取相应质量的7 种防腐剂（精确到0.001），使用无菌水溶解配制，使用前经0.45 μm无菌滤膜过滤。防腐剂使用质量浓度见表1。 1.3.4 芽孢生长曲线的绘制 采用MRS肉汤培养基为基质，使用全自动生长曲线分析仪通过测定600 nm波长下OD值的变化，绘制芽孢生长曲线，研究其生长规律。 1.3.5 不同温度热胁迫处理芽孢 取适当稀释的芽孢悬液，充分振荡后等体积分装于含10 mL液体培养基的试管中，研究已萌发芽孢耐热性规律，分别于90、95、100、105、110、115、120 ℃油浴下加热0、10、15、20、25、30、35、40 min，之后放入冰水浴迅速冷却，对照组在相同加热条件冷却后接入相同量芽孢，通过平板计数法测定芽孢菌落总数[29]，计算芽孢热致死率，并采用全自动生长曲线分析仪测定其生长曲线，研究不同温度及不同热胁迫时间对芽孢致死规律影响，重复3 次取平均值。芽孢致死率计算如式（3）所示。 由表2可知，该凝结芽孢杆菌芽孢仅有葡萄糖可以促进其萌发。芽孢萌发过程需要芽孢内膜上的受体蛋白作用，一般称之为萌发受体（germinant receptor，GR）。通过受体蛋白与萌发剂的特异性结合从而诱发芽孢萌发过程。有学者对枯草芽孢杆菌等菌株的芽孢萌发特性研究中发现，L-丙氨酸是促进芽孢萌发的必要营养剂，主要由于其內膜含有GerA、GerB和GerK三类萌发受体，其中GerA可以与L-丙氨酸结合诱导芽孢萌发，可见，不同菌种间芽孢萌发特性不同[31]。 2.2 葡萄糖诱导芽孢萌发特性及标准曲线 图2为芽孢悬液中加入萌发剂后在40 ℃条件下测定其萌发期间OD值变化，未萌发的芽孢不具透光性，随着芽孢萌发为营养体其折光性消失从而透光性增强，吸光度也逐渐降低。未加萌发剂的芽孢悬液其OD值基本保持不变，加入萌发剂后在20 min开始出现OD值降低，结合镜检发现此时有少数芽孢开始萌发，当培养时间达180 min时OD值基本稳定不变，说明芽孢基本萌发完全，通过镜检验证发现芽孢萌发率在95%以上，最高达到98.86%。萌发率未达到100%可能是由于极少数芽孢具有较强抗性，很难萌发，通常称其为“超级芽孢”。超级芽孢形成的确切原因还未确定，但部分研究表明，可能是由于部分芽孢个体缺少特定数量萌发受体，或受体蛋白表达过程中出现个别变异情况导致萌发受体种类及数量缺失，从而使得超级芽孢萌发过程会长时间滞后甚至永久不萌发[32]。 以50 mmol/L的葡萄糖溶液作为芽孢促萌发营养剂，将稀释到适宜浓度的芽孢悬液分别在40 ℃条件下培养测定OD值并镜检观察其萌发率，以镜检萌发率为横坐标，以OD值降低率为纵坐标绘制标准曲线，获得的标准曲线为y=0.633x-14.454，相关系数为0.977 8，说明可以使用芽孢液OD值的降低率来代替镜检测定芽孢萌发率，从而降低通过镜检计数萌发率的繁琐度。研究中发现，当OD值降低45%时芽孢萌发率可达到95%，当OD值降低50%时可以认为芽孢萌发率接近100%。 由图3可知，对照组OD值基本不变，说明芽孢没有萌发，而添加葡萄糖后芽孢在180 min左右OD值基本不变说明芽孢基本萌发完全。使用较低浓度葡萄糖时OD值到终点时降低率略低于中、高浓度葡萄糖溶液，可能是由于其含量过低，致使少量芽孢未能萌发。从萌发时间上看，使用高浓度的葡萄糖溶液诱导芽孢萌发时间仅略微提前几分钟，说明芽孢萌发过程需要特定时间，增加萌发剂的浓度并不能明显加速萌发过程，可能与芽孢萌发需要膜中蛋白受体作用，而作用时间是固定的相关。 2.3 防腐剂对芽孢萌发效果影响 由图4可知，使用乳酸钠、葡萄糖酸-δ-内酯和双乙酸钠分别单独加入到芽孢萌发体系中时，初始OD值明显低于其他组，这是由于这3 种防腐剂的加入致使芽孢出现抱团现象，从而不能均匀地分散到液体中导致OD值偏低，在培养过程中OD值也没有明显降低现象，说明芽孢没有萌发，通过镜检验证发现芽孢确实没有萌发；含双乙酸钠的萌发体系中在50 min时OD值有小幅降低，说明部分芽孢萌发；分别含亚硝酸钠、山梨酸钾、乳酸链球菌素和脱氢乙酸钠的萌发体系中芽孢正常萌发，加入山梨酸钾在培养50 min时可以一定程度上加速芽孢的萌发，其机理还有待验证。国外一些学者研究中发现乳酸链球菌素[33-35]不能抑制芽孢的萌发，但可以抑制已萌发芽孢的生长，而山梨酸钾[14]对芽孢萌发及生长均有抑制作用，这与本研究结果有一定差异，可能是由于不同菌种芽孢差异性所致。 2.4 凝结芽孢杆菌芽孢生长规律 图5为采用MRS肉汤培养基为基质测定的芽孢生长曲线图，在40 ℃培养条件下芽孢在0～5 h内为生长延滞期，5～14 h内为生长对数期，OD值从0.245升至0.996，14 h之后进入稳定期。前期研究[27]表明，筛选出的该凝结芽孢杆菌营养菌体在培养2 h后进入生长对数期，并持续到12 h，而本研究中对其芽孢生长曲线研究发现进入生长对数期的时间延后约3 h，因为芽孢在液体培养基中培养期间需要先完成萌发过程变为营养体细胞，然后才开始正常的细菌生长过程。 2.5 不同热胁迫温度对芽孢致死规律影响 细菌的营养细胞在70～80 ℃时10 min就死亡，而芽孢形成后由于有致密的芽孢壁，内部含有丰富的2，6-吡啶二羧酸及耐热小分子酶类，因此具有较高的耐热性，芽孢萌发形成营养细胞时2，6-吡啶二羧酸释放到体外，孢子壁也变为细胞壁从而丧失耐热性。 由图6可知，采用90 ℃和95 ℃处理的芽孢随加热时间延长对芽孢致死效果缓慢提高，加热到40 min时致死率分别为47.55%、54.18%，说明即便是已经萌发的芽孢液在其成长为完全的营养体前也具有较高耐热性，在90 ℃和95 ℃热胁迫下短时间内杀灭效果不理想。当热胁迫温度为100℃时，处理时间低于15 min对其芽孢致死率也比较低，当时间继续延长到25 min时致死率达83.48%，继续加热最终芽孢致死率在92.09%。当热胁迫温度升高到105 ℃的时候，20 min内芽孢致死率迅速上升接近100%，而采用110 ℃处理则在15 min内致死率接近100%。115 ℃条件下热处理10 min对芽孢致死率高达89.66%，15 min后接近100%；采用120 ℃高温胁迫处理时10 min就几乎杀灭全部芽孢菌体。 图7～10为凝结芽孢杆菌分别在95、100、105、110 ℃条件下热处理不同时间后生长曲线。 正常芽孢培养5 h即进入生长对数期，当热胁迫温度为90 ℃时加热不同时间后芽孢生长曲线几乎重合且与对照组并无明显差异。采用115 ℃及120 ℃处理的芽孢在45 h内除10 min热处理的芽孢外几乎不生长，故图未列出。95 ℃处理的芽孢即使经历40 min处理其达到生长对数期的时间也仅延长3 h，说明活体菌数依旧很高；采用100 ℃处理的芽孢热胁迫时间每延长5 min其达到对数期的时间也延长约3 h，当加热时间到35 min及40 min时生长对数期延长约15 h，且两者间差异较小，与致死率结果一致；当热处理温度为105 ℃时加热10 min后芽孢进入对数期的时间明显推迟5 h，随着加热时间延长进入对数期的时间也逐渐推迟；采用110 ℃加热10 min芽孢进入对数期的时间已推迟10 h，加热40 min的芽孢进入对数期时间推迟达20 h。 綜上可以看出，90～100 ℃的热胁迫处理对芽孢致死效果及存活芽孢生长抑制效果一般，且较长时间的加热若应用于产品加工制作不利于产品品质及能源节约，采用105 ℃及110 ℃的中温刺激条件虽然不能达到115～120 ℃的高温灭菌效果，但也可以大幅提高对芽孢杆菌的灭菌效果。 3 结 论 凝结芽孢杆菌的芽孢在培养基中40 ℃培养条件下经历约5 h进入生长对数期，14 h后进入平稳期，进入对数期的时间较菌体直接培养迟滞3 h，呈典型S形生长曲线。该菌株对葡萄糖有良好的萌发效应，在20 min内即开始萌发。亚硝酸钠、山梨酸钾、乳酸链球菌素和脱氢乙酸钠4 种防腐剂不能阻碍葡萄糖对芽孢的萌发促进效果，结合前期研究，使用少量的乳酸链球菌素即可对该凝结芽孢杆菌抑制率达99%，综合研究来看，说明乳酸链球菌素对该菌株的芽孢萌发没有抑制作用，即在有乳酸链球菌素的存在下该菌的芽孢可以通过葡萄糖诱导萌发成长为营养细胞，然后乳酸链球菌素可以抑制营养细胞继续增殖，从而发挥其抑菌作用；山梨酸钾可以一定程度上加快芽孢萌发过程，这为中温肉制品生产中防腐剂复合使用提供参考。从热胁迫处理对凝结芽孢杆菌芽孢研究中发现，对于刚萌发的凝结芽孢杆菌仍有较高耐热性，可耐受105 ℃短时高温，但在110 ℃条件下可以有效杀灭已萌发芽孢。 从本研究可以发现，通过特定营养剂诱导芽孢萌发，但肉制品中微生物体系较为复杂，其实际应用效果及其他种类芽孢杆菌芽孢诱导萌发研究仍需进一步探究。 参考文献： [1] 余岳， 王春维， 祝爱侠， 等. 一株凝结芽孢杆菌芽孢抗逆性研究及其产孢条件优化[J]. 饲料工业， 2013（7）： 43-47. 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