| 标题 | 加速溶剂萃取—高效液相色谱—荧光检测法测定哈尔滨红肠中的4 种多环芳烃 |
| 范文 | 摘 要：利用加速溶剂萃取-高效液相色谱-荧光检测（accelerated solvent extractor-high performance liquid chromategraphy-fluorescent detection，ASE-HPLC-FLD）技术，建立快速同时检测哈尔滨红肠中4 种多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）的定量分析方法。采用优化后的ASE和HPLC条件进行测定，外标法定量。结果表明：苯并（a）芘（benzo（a）pyrene，B（a）P）、苯并（a）蒽（benzo（a）anthracene， B（a）A）、?（chrysene，CHR）和苯并（b）荧蒽（benzo（b）fluoranthene，B（b）F）4 种PAHs的校正曲线线性关系良好，R2>0.999 0；B（a）A、CHR、B（b）F和B（a）P的方法检出限分别为1.016、1.872、0.428、 0.104 μg/kg；加标回收率均在50%～90%之间，相对标准偏差均小于8%；5 种哈尔滨红肠中PAHs的总含量均远低于欧盟标准（30 μg/kg）。本方法可以同时检测哈尔滨红肠中的4 种PAHs，且灵敏度和准确度较高、重现性好、易操作，适用于哈尔滨红肠中PAHs的日常快速测定与分析。 关键词：哈尔滨红肠；多环芳烃；高效液相色谱；荧光检测 Abstract： A quantitative analysis method for four polycyclic aromatic hydrocarbons （PAHs） in Harbin red sausage was established by accelerated solvent extraction coupled with high performance liquid chromatography with fluorescence detection （ASE-HPLC-FLD）. The extraction and chromatographic conditions were optimized and the quantification was carried out by the external standard method. The results showed that the calibration curves for all four PAHs， benzo （a） anthracene （B（a）A）， chrysene （CHR）， benzo（b） fluoranthene （B（b）F）， benzo （a） pyrene （B（a）P）， were linear with correlation coefficient （R2） greater than 0.999 0. The detection limits for the PAHs were 1.016， 1.872， 0.428 and 0.104 μg/kg， respectively. Overall recoveries from spiked samples were between 50% and 90% with relative standard deviation （RSD） below 8%. All the PAHs were detected simultaneously， sensitively， conveniently and accurately with high reproducibility by this method， making it useful for rapid determination of PAHs in Harbin red sausages. Key words： Harbin red sausage； polycyclic aromatic hydrocarbons （PAHs）； high performance liquid chromatography （HPLC）； fluorescence detection DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201712007 中图分类号：R155.5 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2017）12-0036-05 引文格式： 李聪， 赵颖， 徐宝才， 等. 加速溶剂萃取-高效液相色谱-荧光检测法测定哈尔滨红肠中的4 种多环芳烃[J]. 肉类研究， 2017， 31（12）： 36-40. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201712007. http：//www.rlyj.pub LI Cong， ZHAO Ying， XU Baocai， et al. Detection of four polycyclic aromatic hydrocarbons in Harbin red sausage by accelerated solvent extraction coupled with high performance liquid chromatography with fluorescence detection[J]. Meat Research， 2017， 31（12）： 36-40. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201712007. http：//www.rlyj.pub 哈爾滨红肠是我国东北地区的传统肉制品，凭借其蒜香袭人、烟熏味适当、肥而不腻的“三大法宝”深受广大消费者的喜爱[1]。但作为一种传统的烟熏肉制品，哈尔滨红肠会在生产过程中由于环境、加工方式和包装方式等原因受到多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）污染[2-4]。 PAHs是一类含有2 个及2 个以上苯环、对环境和食品均可造成强烈污染的环状化合物[5]。PAHs具有脂溶性，且极难降解，会在人体中富集，同时具有强烈的致癌性和致突变性，严重威胁人类健康[2，6-9]。作为PAHs的一种，苯并（a）芘（benzo（a）pyrene，B（a）P）占全部致癌性PAHs的1%～20%，具有致癌性强、性质稳定、检测方法灵敏，且与其他PAHs有一定相关性等特点，常被用作指标化合物[10-13]。2012年，我国在强制性食品安全标准GB 2762—2012《食品安全国家标准 食品中污染物限量》中规定熏、烤、烧类肉制品中的B（a）P限量为5 μg/kg； 而欧盟2011年规定了食品中PAHs污染的另一个评价指标为苯并（a）蒽（benzo（a）anthracene，B（a）A）、 ?（chrysene，CHR）、苯并（b）荧蒽（benzo（b）fluoranthene，B（b）F）以及B（a）P的总含量，同时规定了熏肉制品中上述4 种PAHs的总残留限量为 30 μg/kg[14]。相较于欧盟以4 种PAHs的总含量作为评价指标，我国单纯以B（a）P的含量作为评价指标得出的结果较为片面。因此，建立能够快速同时测定4 种PAHs含量的方法具有重要意义。 目前，可以通过高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法[15]、氣相色谱（gas chromatography，GC）法[16]、气相色谱-质谱（GC-mass spectrometry，GC-MS）法[17-18]、毛细管电泳法[19]、二阶激光质谱法[20]和酶联免疫分析法[21]对PAHs进行检测。HPLC具有操作简单、重现性好、定量精确等特点，已有许多研究采用HPLC结合荧光检测器测定食物中PAHs的含量[22-28]，但采用国标方法提取肉制品中的PAHs需要耗费大量溶剂和人力，加速溶剂萃取（accelerated solvent extraction，ASE）技术可以有效减少样品的前处理时间，提高萃取效率，例如，Wang等[29]采用ASE-GC-MS法测定烟熏食品中残留的16 种PAHs，Suranová等[30]采用ASE法建立了符合欧盟标准的熏肉中PAHs的测定方法。本研究采用ASE技术对哈尔滨红肠样品进行前处理，采用HPLC仪结合荧光检测器建立样品中4 种PAHs的测定方法，同时为我国烟熏肉制品中4 种PAHs的检测提供思路，使得我国的PAHs检测能够尽早与欧盟等国家接轨。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 5 种哈尔滨红肠样品均为市售。 环己烷、甲醇、乙腈、硅胶 美国Fluka公司； 聚丙烯酸钠 美国Sigma-Aldrich公司；B（a）A、CHR、B（b）F标准品 美国Supelco公司；B（a）P标准品 美国Sigma公司。HPLC仪用水均为超纯水，所用试剂均为色谱纯。 1.2 仪器与设备 ASE-350加速溶剂萃取仪（配备22 mL萃取池） 美国Thermo公司；Waters alliance E2695高效液相色谱仪（配备2475荧光检测器） 美国Agilent公司；3K15高速离心机 德国Sigma公司；G-560E涡旋混匀器 美国Scientific Industries公司；Heidolph旋转蒸发仪 美国Tedia公司。 1.3 方法 1.3.1 样品处理 精确称取1.000 0 g肉糜样品，加入等质量的聚丙烯酸钠，搅拌均匀。将5 g活化后的硅胶、混匀后的肉糜样品以及硅藻土依次装填入萃取池中，拧紧池帽。ASE条件：萃取温度100 ℃，加热时间5 min，冲洗体积50%，静态萃取时间6 min，循环3 次，吹扫时间120 s。萃取结束后，将萃取液转移至鸡心瓶中，55 ℃条件下旋转浓缩至溶剂蒸发完全，用一定量的甲醇溶解，室温下 10 000 r/min离心5 min；将上清液过0.22 μm有机相滤膜，弃初滤液，取1 mL加入进样瓶，待上机测定。 1.3.2 HPLC条件 通过对SunFire TM-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Zorbax Eclipse PAH色谱柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）的分离效果进行对比分析，发现SunFire TM-C18色谱柱无法对B（a）A和CHR进行有效分离，采用PAHs分离专用柱Zorbax Eclipse PAH色谱柱时，可以实现4 种PAHs的分离，且峰型较好。对Zorbax Eclipse PAH色谱柱的流动相、柱温、进样量以及流速进行优化，得出最佳色谱条件。 1.3.3 标准曲线的绘制 配制4 种PAHs的混合标准工作液，确保每种PAHs的质量浓度均为150 ng/mL；准确吸取2 mL上述工作液于10 mL棕色瓶中，用甲醇定容，并充分混匀，梯度稀释至各PAHs的质量浓度分别为30.0、15.0、7.5、2.5、1.0、0.5 ng/mL。分别吸取混匀后的溶液1 mL至进样瓶中，采用优化好的HPLC条件进行测定，并分别以4 种PAHs的质量浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。 1.3.4 加标回收率的计算 精确称取1.000 0 g肉糜样品2 份，向其中1 份中加入不同体积的PAHs混合标准溶液，使其质量浓度分别为15.0、2.5、1.0 μg/kg。按照1.3.1节的方法进行前处理后，进行HPLC测定。按照公式（1）计算加标回收率。 2 结果与分析 2.1 4 种PAHs的萃取 ASE法在高温和高压条件下进行，温度升高，溶剂穿透力增强，且表面张力下降，能够加快化合物从基体解吸进入溶剂的速率；加压使溶剂保持液态，采用少量溶剂即可快速提取固体样品中的化合物。萃取温度和时间是影响回收率的关键因素。实验证明，萃取温度100 ℃、加热时间5 min、冲洗体积50%、静态萃取时间6 min、循环3 次、吹扫时间120 s时的回收率最高。与传统的匀浆提取或超声波提取相比，采用ASE法萃取时，每个样品只需20 mL溶剂萃取10 min即可，且萃取过程全部自动化，不但节省溶剂，而且操作简单、省时省力。 2.2 HPLC条件的确定 对Zorbax Eclipse PAH色谱柱的流动相、柱温、进样量以及流速进行优化，确定最佳色谱条件。初始流动相为乙腈∶水=38∶62（V/V），梯度洗脱程序如表1所示，柱温25 ℃，进样量20 μL，进样流速2 mL/min。根据4 种PAHs的特性，设置荧光检测程序如表2所示。 2.3 标准曲线的绘制和方法检出限 各PAHs的质量浓度均为30 ng/mL时，混合标准溶液的HPLC图如图1所示。 由表3可知，各PAHs的质量浓度与峰面积的线性关系良好，R2均大于0.999 0，B（a）A、CHR、B（b）F和B（a）P的方法检出限分别为1.016、1.872、0.428、0.104 μg/kg；按照3 倍信噪比（RS/N）計算得到的仪器检出限为0.020 μg/kg。本方法的线性范围较宽，但实际样品中PAHs的含量差别较大，可以根据实际情况选取工作曲线的线性范围。 2.4 回收率实验 由表4可知，在3 个加标水平下，4 种PAHs的平均回收率均在50%～90%之间，相对标准偏差均小于8%，表明采用ASE法能同时对红肠中4 种PAHs进行有效萃取，且检测灵敏度和准确度较高。 2.5 哈尔滨红肠样品的测定 采用本研究所建立的方法测定5 种市售哈尔滨红肠中PAHs的含量，将5 种产品分别编号为QL、HJ、HJZ、LDF和DTF。5 种产品的HPLC图如图2所示。 由表5可知，5 种哈尔滨红肠中B（a）P的含量均低于国家标准（5 μg/kg），4 种PAHs的总含量均低于欧盟标准（30 μg/kg）。 3 结 论 本研究采用ASE法对哈尔滨红肠中的PAHs进行提取，并对提取液进行浓缩、净化后，采用HPLC法进行检测。结果表明，4 种PAHs的线性关系良好，R2>0.999 0；3 种浓度下的加标回收率为50%～90%；所测5 种哈尔滨红肠样品中4 种PAHs的总含量均低于欧盟标准（30 μg/kg），B（a）P含量均低于国家标准（5 μg/kg）。本方法操作简便、提取效率高、重现性好、回收率较高，可以作为测定哈尔滨红肠中4 种PAHs的一种方法。 参考文献： [1] 王盼盼. 中国名产篇之十一： 哈尔滨红肠[J]. 肉类研究， 2009， 23（11）： 1. [2] JIRA W. Polycyclic aromatic hydrocarbons in German smoked meat products[J]. European Food Research and Technology， 2010， 230（3）： 447-455. DOI：10.1007/s00217-009-1187-9. [3] 李永新， 张宏， 毛丽莎， 等. 气相色谱-质谱法测定熏肉中的多环芳烃[J]. 色谱， 2003， 21（5）： 476-479. DOI：10.3321/j.issn：1000-8713.2003.05.009. [4] 万红丽， 周光宏， 徐幸莲， 等. 肉制品中多环芳烃前处理技术的研究进展[J]. 食品研究与开发， 2006， 27（8）： 124-126. DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2006.08.039. [5] 万红丽， 吉艳峰， 周光宏， 等. 固相萃取技术及其在肉制品中多环芳烃分析的应用[J]. 食品与发酵工业， 2006， 32（12）： 104-107. DOI：10.3321/j.issn：0253-990X.2006.12.025. [6] MAN Y B， KANG Y， WANG H S， et al. Cancer risk assessments of Hong Kong soils contaminated by polycyclic caromatic hydrocarbons[J]. Journal of Hazardous Materials， 2013， 261： 770-776. DOI：10.1016/j.jhazmat.2012.11.067. [7] FORSBERG N D， STONE D， HARDING A， et al. Effect of native American fish smoking methods on dietary exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons and possible risks to human health[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2012， 60（27）： 6899-6906. DOI：10.1021/jf300978m. [8] WRETLING S， ERISSON A， ESKHULT G A， et al. Polycyclic aromatic hydrocarbons （PAHs） in Swedish smoked meat and fish[J]. Journal of Food Composition and Analysis， 2010， 23（3）： 264-272. DOI：10.1016/j.jfca.2009.10.003. [9] 芦静， 贾玉巧， 高艳荣， 等. 多环芳烃的致癌性机制研究进展[J]. 中国疗养医学， 2014， 23（9）： 787-789. DOI：10.13517/j.cnki.ccm.2014.09.009. [10] 崔国梅， 彭增起， 孟晓霞. 烟熏肉制品中多环芳烃的来源及控制方法[J]. 食品研究与开发， 2010， 31（3）： 180-183. DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2010.03.054. [11] 李晓波. 熏烤肉制品熏烟成分及其有害成分的控制[J]. 肉类研究， 2009， 23（6）： 37-41. [12] 孟晓霞， 彭增起， 冯云. 煎炸对肉制品中杂环胺及多环芳香烃化合物含量的影响及其控制措施[J]. 肉类研究， 2009， 23（6）： 52-55. [13] 黄靖芬， 李来好， 陈胜军， 等. 烟熏食品中苯并（a）芘的产生机理及防止方法[J]. 现代食品科技， 2007， 23（7）： 60-67. DOI：10.3969/j.issn.1673-9078.2007.07.020. [14] 赵冰， 任琳， 李家鹏， 等. 传统肉制品中多环芳烃来源和检测方法研究进展[J]. 肉类研究， 2012， 26（6）： 50-53. [15] BLASZCYK U， JANOSZKA B. Analysis of azaarenes in pan fried meat and its gravy by liquid chromatography with fluorescence detection[J]. Food Chemistry， 2008， 109（1）： 235-242. DOI：10.1016/j.foodchem.2007.12.038. [16] KULIKOVSKII A V， VOSTRIKOVA N L， CHEMUKHA S M， et al. Methodology of the determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in foods[J]. Journal of Analytical Chemistry， 2014， 69（2）： 205-209. DOI：10.1134/s1061934813120058. [17] 裴德君， 连秋燕， 施点望， 等. 气相色谱-质谱联用法同时测定纺织品中的8 种多环芳烃[J]. 分析测试学报， 2016， 35（4）： 443-447. DOI：10.3969/j.issn.1004-4957.2016.04.012. [18] 骆和东， 周娜， 叶雅真， 等. 气相色谱-质谱联用法测定食品用纸容器中的16 种多环芳烃[J]. 中国卫生检验杂志， 2012（10）： 2280-2283. [19] KOCH J T， BEAM B， PHILLIOS K S， et al. Hydrophobic interaction electrokinetic chromatography for the separation of polycyclic aromatic hydrocarbons using non-aqueous matrices[J]. Journal of Chromatography A， 2001， 914（1）： 223-231. DOI：10.1016/S0021-9673（01）00521-0. [20] EMMENEGGER C， KALBERER M， MORRICAL B， et al. Quantitative analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons in water in the low-nanogram per liter range with two-step laser mass spectrometry[J]. Analytical Chemistry， 2003， 75（17）： 4508-4513. DOI：10.1021/ac0340197. [21] BARCELO D， OUBINA A， SALAU J S， et al. Determination of PAHs in river water samples by ELISA[J]. Analytica Chimica Acta， 1998， 376（1）： 49-53. DOI：10.1016/S0003-2670（98）00447-4. [22] 刘先德. 高效液相色谱在食品质量检测中的应用[J]. 中国高新技术企业， 2015（18）： 50-52. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201708010. [23] 趙佳莹， 李晓敏， 卢晓华， 等. 高效液相色谱-荧光检测法测定橄榄油中4 种多环芳烃[J]. 色谱， 2017， 35（7）： 748-754. DOI：10.3724/SP.J.1123.2017.03040. [24] 孙秀梅， 梅光明， 陈雪昌， 等. 高效液相色谱-荧光检测法测定水产品中15 种多环芳烃[J]. 南方水产， 2012， 8（3）： 48-53. DOI：10.3969/j.issn.2095-0780.2012.03.007. [25] 屠泽慧， 聂文， 王尚英， 等. 烧烤及烟熏肉制品中多环芳烃的迁移、转化与控制研究进展[J]. 肉类研究， 2017， 31（8）： 49-54. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201708010. [26] 吕东岩， 刘斌， 王庆峰， 等. 进出口食品级润滑油（脂）中多环芳烃残留量的测定[J]. 中国科技信息， 2017（15）： 82. DOI：10.3969/j.issn.1001-8972.2017.15.029. [27] 刘玉兰， 张东东， 温运启， 等. 葵花籽油中多环芳烃及色泽的吸附脱除研究[J]. 中国粮油学报， 2017， 32（6）： 100-106. DOI：10.3969/j.issn.1003-0174.2017.06.018. [28] 何立坚， 章汝平， 恒能量. 同步荧光法测定茶叶中多环芳烃[J]. 龙岩学院学报， 2016， 34（2）： 97-100. DOI：10.3969/j.issn.1003-0174.2017.06.018. [29] WANG G， LEE A S， LEWIS M， et al. Accelerated solvent extraction and gas chromatography-mass spectrometry for determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in smoked food samples[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1999， 47（3）： 1062-1066. DOI：10.1021/jf980956h. [30] SURANOV? M， SEMANOV? J， SKL?R?OV? B， et al. Application of accelerated solvent extraction for simultaneous isolation and pre-cleaning up procedure during determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in smoked meat products[J]. Food Analytical Methods， 2015， 8（4）： 1014-1020. DOI：10.1007/s12161-014-9977-5. |
| 随便看 |
|
科学优质学术资源、百科知识分享平台，免费提供知识科普、生活经验分享、中外学术论文、各类范文、学术文献、教学资料、学术期刊、会议、报纸、杂志、工具书等各类资源检索、在线阅读和软件app下载服务。