摘 要：根据之前的研究成果体外模拟伊拉兔肌内磷脂n-3 多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）的组成，并研究其功能特性。结果表明：采用噻唑蓝法对复合n-3 PUFAs作用的敏感细胞进行筛选，证实伊拉兔肌内磷脂n-3 PUFAs在30～180 μmol/L劑量范围对HepG2、MV3和A375肿瘤细胞的生长均有抑制作用，且HepG2细胞对复合肌内磷脂n-3 PUFAs的敏感度最高；HepG2的细胞形态及数量变化与复合n-3 PUFAs呈现明显的时效和量效关系；采用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素和碘化丙啶双染法对肿瘤细胞进行凋亡检测，证实伊拉兔肌内复合磷脂n-3 PUFAs的凋亡作用；进一步研究发现，复合n-3 PUFAs及其单体（α-亚麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸）均能够引起HepG2细胞内氧化应激的改变，它们通过显著上调细胞内丙二醛的累积量以及活性氧的相对荧光强度水平，同时下调超氧化物歧化酶的活力实现对HepG2细胞的诱导凋亡作用，其中二十二碳六烯酸在非酶促氧化反应中发挥主要作用，这是肌内磷脂n-3 PUFAs诱导HepG2细胞凋亡的机制之一。

    关键词：伊拉兔；肌内磷脂；n-3多不饱和脂肪酸；抗肿瘤；脂质过氧化

    Abstract： As an extension of our previous work， the composition of n-3 polyunsaturated fatty acids （PUFAs） in intramuscular phospholipids of Hyla rabbit was simulated in vitro to evaluate their functional characteristics. The sensitivity of various tumor cells to the formulation was tested by the methyl thiazolyl tetrazolium method. It turned out that the formulation at doses in the range of 30–180 μmol/L repressed the growth of HepG2， MV3 and A375 tumor cells， HepG2 cells being most sensitive to the formulation. The formulation affected the morphology and quantity of HepG cells in a time- and dose-dependent manner and it induced apoptosis in the tumor cells as determined by Annexin V-fluorescin isothiocyanate and propidium iodide double staining kit. Furthermore， the formulation and the individual PUFAs （α-linolenic acid， eicosapentaenoic acid， docosapentaenoic acid， and docosahexenoic acid （DHA）） could alter oxidative stress in HepG cells and their apoptosis-inducing activity was associated with a significant increase in cellular malondialdehyde accumulation and the relative fluorescence intensity of reactive oxygen species and with a decrease in superoxide dismutase activity. In addition， DHA played a major role in the non-enzymatic oxidation reaction.

    Keywords： Hyla rabbit； intramuscular phospholipids； n-3 polyunsaturated fatty acids； anticancer effect； lipid peroxidation

    DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201804002

    中图分类号：TS201.4 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2018）04-0007-07

    根据世界癌症组织的报告，恶性肿瘤导致的死亡人数高达全球总死亡人数的12%，甚至在很多国家1/4的死亡原因都归结于癌症[1]。全球诊断出来的最常见的癌症包括肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌以及结直肠癌等[1-2]。大量流行病学资料显示，摄入脂肪的种类和数量与恶性肿瘤的发生与发展有密切关系[3-4]。很多研究表明，高水平饱和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）的摄入会增加罹患恶性肿瘤的风险，而n-3多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）的摄入能够大大降低这种风险，同时也有利于肿瘤病人的治疗和预防复发[5-7]。大量动物实验及体外细胞实验证实，n-3 PUFAs具有明显抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞分化和诱导肿瘤凋亡的作用，如对胃癌[8-9]、乳腺癌[10]、结直肠癌、前列腺癌[11]和胰腺癌[12]等疗效显著。长链的n-3 PUFAs，尤其是二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexenoic acid，DHA）对肿瘤细胞的作用更为突出，并且诱导肿瘤凋亡的途径与机制是复杂多变的[13-14]。

    本研究首先通过探究伊拉兔肌内磷脂n-3 PUFAs对HepG2（人肝癌细胞株）、MV3（野生型黑素瘤细胞株）和A375（人黑素瘤细胞株）的作用，筛选敏感细胞株；其次，通过n-3 PUFAs与敏感细胞株的时效及量效关系确定不同作用剂量与培养时间对敏感细胞株的影响，进而对不同n-3 PUFAs添加量和培养时间条件下敏感细胞株的细胞形态、抑制效果和细胞凋亡等指标进行深入研究，探讨伊拉兔肌内磷脂n-3 PUFAs对敏感细胞株的作用效果；此外，通过试剂盒法检测伊拉兔肌内磷脂中n-3 PUFAs对肿瘤细胞氧化应激的影响，即分别用α-亚麻酸（α-linolenic acid，ALA）、EPA、二十二碳五烯酸（docosapentaenoic acid，DPA）、DHA和复合n-3 PUFAs处理敏感细胞株，检测肿瘤细胞内丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）以及活性氧（reactive oxygen species，ROS）的变化，以期揭示伊拉兔肌内磷脂n-3 PUFAs体外抑制肿瘤细胞增殖的作用机制，同时也为兔产业的推广和推进提供参考。

    1 材料与方法

    1.1 材料与试剂

    冷却兔肉取自西南大学动物科学学院养殖场的伊拉配套系肉兔，同一批次饲养，饲养环境和饲料均相同。公兔，20 只，60 日龄，体质量（2.15±0.12） kg。肉兔经屠宰分割后，取背部最长肌作为实验原料，用装有碎冰的保温箱将其立即运回实验室（20 min之内），真空包装后于-18 ℃保藏备用。使用前将原料在4 ℃条件下解冻24 h后，去掉表面可见脂肪和筋膜，分割切块。

    n-3 PUFAs：ALA标准品（纯度99.8%）、EPA标准品（纯度99.8%）、DPA标准品（纯度99.8%）和DHA标准品（纯度99.8%） 上海安谱仪器有限公司；HepG2、A375和MV3细胞株 西南大学洁净能源与先进材料研究院细胞库。

    14%三氟化硼甲醇溶液（色谱纯） 美国CNW公司；脂肪酸甲酯标准品（色谱纯） 美国Sigma公司；PBS溶液、DMEM培养基和RPMI 1640培养基 美国Gibco公司；胎牛血清 天津TBD公司；双抗（青霉素、链霉素）和胰酶 北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）試剂和细胞裂解液RIPA Buffer 美国Sigma公司；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-fluorescin isothiocyanate，Annexin V-FITC）细胞凋亡检测试剂盒、MDA测定试剂盒、SOD测定试剂盒、ROS测定试剂盒和蛋白质定量测定试剂盒 南京建成生物工程研究所有限公司；三氯甲烷、甲醇、氯化钠、氯化钙、无水硫酸（均为分析纯） 成都市科龙化工试剂厂。

    1.2 仪器与设备

    QP-2010气相色谱仪 日本Shimadzu公司；Rtx-Wax毛细管色谱柱 美国Restek公司；RE-52A旋转蒸发器、SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵 上海市亚荣生化仪器厂；SHA-CD恒温振荡器 金坛市富华仪器有限公司；DG3022酶标仪 美国Bio-Tek公司；DFM-20C荧光倒置显微镜 美国Olympus公司；NU-3500细胞培养箱 德国Nuaice公司；DY89-1玻璃匀浆器 宁波新芝仪器有限公司；H1650-W高速离心机 湖南湘仪集团；F-7000荧光分光光度仪 日立高新技术公司；SG-40干式试管加热器 德国HLC生物技术公司；SX-700高压灭菌锅 日本Tomy公司。

    1.3 方法

    1.3.1 伊拉兔肌内磷脂n-3 PUFAs的组成测定磷脂的提取：脂肪提取、肌内中性脂肪和磷脂的分离采用薛山等[15-16]的方法。

    磷脂脂肪酸组成分析：样品前处理及脂肪酸甲酯的气相色谱（gas chromatography，GC）测定均参考文献[15-16]的方法；脂肪酸的定性分析采用与37 种混合脂肪酸甲酯标准品的保留时间进行对比的方法进行，定量分析采用面积归一化法，脂肪酸含量用单个脂肪酸占总脂肪酸的相对比例（%）表示。

    1.3.2 伊拉兔肌内磷脂n-3 PUFAs的制备

    1.3.2.1 母液配制

    准确称取各标准品，分别配制20 mmol/L的ALA、4 000 ?mol/L的EPA、4 000 ?mol/L的DPA和4 000 ?mol/L的DHA储备液；储备液经0.22 ?m滤膜过滤后分装于1.5 mL离心管中，-20 ℃保存备用。使用时将储备液用细胞培养液稀释至所需浓度。

    1.3.2.2 复合n-3 PUFAs储备液的配制

    按照文献[17-18]测得的60 日龄伊拉公兔（体质量（2.15±0.12） kg）背部最长肌磷脂的n-3 PUFAs组成进行肌内磷脂n-3 PUFAs的复配，如表1所示。用无血清培养液将复配所得复合n-3 PUFAs配制成4 000 ?mol/L的储备液，经0.22 ?m滤膜过滤后分装于1.5 mL离心管中，-20 ℃避光保存备用。需要指出的是，当NaOH的终浓度低于0.001 mol/L或乙醇的终体积分数低于0.6%时，均对细胞无毒性作用。

    1.3.3 肿瘤细胞系生长培养基的配制

    HepG2（人肝癌细胞株）生长培养基：RPMI 1640培养基+10%胎牛血清+1%双抗；A375（人黑素瘤细胞株）生长培养基：DMEM培养基+10%胎牛血清+1%双抗；MV3（野生型黑素瘤细胞株）生长培养基：DMEM培养基+10%胎牛血清+1%双抗。

    1.3.4 n-3 PUFAs敏感细胞株的筛选

    1.3.4.1 细胞接种

    参考Dai Jinfeng等[9]的方法。轻轻吸出原有培养液及未贴壁的细胞，先用1 mL PBS溶液反复清洗2～3 次，再向培养瓶中加入0.25%胰酶消化液（含有乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA））进行消化，轻轻晃动培养瓶，使消化液均匀覆盖细胞，将培养瓶放回37 ℃、5% CO2培养箱内消化约5 min；取出细胞培养瓶，用倒置显微镜进行光学观察，待肿瘤细胞逐渐变圆时，轻轻晃动培养瓶，使贴壁细胞充分脱落，之后立即加入3 mL新鲜培养基以终止胰酶消化；轻轻摇匀后，慢慢吸出管内含有细胞的胰酶消化液，于1 000 r/min条件下低温离心5 min；弃去管内的上清液，加入新鲜的细胞培养基，轻轻吹打，制成浓度均匀的细胞悬液，以103～105 个/孔的浓度分别铺于6孔板，每个孔的细胞悬液体积均为3 mL。

    1.3.4.2 细胞加药

    采用直接加药法。向上述6孔板中分别加入0、22.5、45.0、67.5、90.0、112.5 μL的4 000 μmol/L复合n-3 PUFAs，使其终浓度分别为0、30、60、90、120、150 μmol/L；用排枪将每孔的溶液吹打均匀后，将6 个孔的细胞悬液以每孔100 μL分别接种于3 块96孔板，继续培养，用于后续测定。每个处理组均设置3 个平行孔，每孔均设置等体积的培养液作为对照，为避免培养过程中水分挥发而引起的边缘效应，边缘孔均设为培养液对照。

    1.3.4.3 呈色

    细胞分别培养24、48、72 h后，每孔加入MTT溶液10 μL；37 ℃继续孵育4 h后，将细胞从培养箱中取出，轻轻将孔内细胞培养上清液去除；分别向细胞培养瓶中加入二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液，150 μL/孔；将96孔板于脱色摇床上振荡10 min，使得结晶物能够充分溶解。

    用酶标仪测定每孔在490 nm波长处的吸光度（A），并按照下式计算细胞活力。

    1.3.5 MTT法检测敏感细胞株的增殖

    采用直接加药法对肿瘤细胞加药，具体操作同1.3.4.2和1.3.4.3节。

    1.3.6 敏感细胞的形态观察

    将敏感细胞的密度调整为1×105 个/mL，分别接种到6孔板，3 mL/孔；分别向上述6孔板的各孔中加入0、22.5、45.0、67.5、90.0、112.5 μL的4 000 μmol/L复合n-3 PUFAs，使其终浓度分别为0、30、60、90、120、150 μmol/L。同时设置不含脂肪酸的培养液作为对照组，培养24、48、72 h后分别用低、中、高倍倒置相差显微镜观察细胞形态。

    1.3.7 敏感细胞凋亡的测定

    根据Annexin V-FITC细胞凋亡测定试剂盒法进行操作。取约1×105～5×105 个重悬的敏感细胞，1 000×g条件下离心5 min；去除上清液，加入500 μL Annexin V-FITC结合液，再次轻轻重悬敏感细胞；加入5 μL Annexin V-FITC溶液，混合均匀后再向反应体系中加入5 μL碘化丙啶（propidium iodide，PI）溶液，轻轻混匀；在室温（20～25 ℃）条件下，采用铝箔避光孵育10 min；将上述染色后的细胞悬液滴于载玻片上，并用盖玻片轻轻盖上细胞，即可用倒置荧光显微镜进行检测。

    1.3.8 n-3 PUFAs及其单体处理对敏感细胞氧化损伤的影响

    敏感细胞中MDA的積累量测定：釆用商业化的MDA试剂盒进行测定。待测样品的蛋白质含量按照考马斯亮蓝法进行测定；敏感细胞中SOD的活性测定：釆用商业化的SOD试剂盒进行测定；敏感细胞中ROS的变化量测定：釆用商业化的ROS试剂盒进行测定。

    1.4 数据处理

    采用SPSS 13.0软件进行数据的统计分析，釆用Origin 8.0软件绘图。数据均以平均值±标准差表示，多组均值比较釆用单因素方差分析，2 组均值比较釆用非配对t检验，当P<0.05时认为差异具有统计学意义。

    2 结果与分析

    2.1 不同肿瘤细胞对n-3 PUFAs敏感度的比较

    由图1可知，伊拉兔背部最长肌肌内磷脂n-3 PUFAs对HepG2、MV3和A375 3 种肿瘤细胞的生长均有一定的抑制作用，且作用浓度不同，细胞的相对活力也存在差异。HepG2细胞受伊拉兔肌内磷脂n-3 PUFAs的抑制较之MV3和A375更为敏感。王占有[19]的研究表明，n-3 PUFAs（EPA和DHA）对HepG2细胞的生长有明显的抑制作用（P<0.05），并且抑制作用随着培养时间的延长而显著增加；当用EPA培养24、48、72 h后，其对肿瘤细胞抑制的半数抑制质量浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分别为（89.09±1.56）、（72.68±2.05）、（56.4±1.38） ?g/mL；当用DHA培养24、48、72 h后，其对肿瘤细胞抑制的IC50分别为（160.87±2.13）、（82.39±1.76）、（70.71±1.52） ?g/mL。然而，目前有关n-3 PUFAs对MV3和A375的诱导作用鲜有报道。

    鉴于HepG2细胞对n-3 PUFAs的较强敏感性，本研究选择HepG2细胞作为研究对象进行后续实验，进一步探讨n-3 PUFAs对HepG2细胞增殖和凋亡的影响及作用机制。

    2.2 n-3 PUFAs对HepG2细胞的时效与量效作用

    由图2可知，HepG2细胞与n-3 PUFAs之间有显著的时效与量效关系。在0～200 μmol/L浓度范围内，随着n-3 PUFAs浓度的增加，HepG2细胞活力显著下降

    （P<0.05）。当培养时间为48 h、n-3 PUFAs添加浓度为200 μmol/L时，HepG2的细胞活力降至（25.70±1.12）%。可见，n-3 PUFAs对HepG2的细胞活力影响明显；当培养时间为72 h时，高剂量的n-3 PUFAs使得肿瘤细胞的活力显著下降，其中180、200 μmol/L处理组HepG2的细胞活力分别降至（5.61±0.16）%和（2.57±0.11）%，此时可以认为细胞的活力几乎为零。因此，后续实验选用30～150 μmol/L的n-3 PUFAs对HepG2细胞进行培养、观察及测定。

    王占有[19]的研究表明：当分别用60 ?g/mL的EPA和DHA作用于HepG2细胞48 h后，细胞的凋亡率分别为12.31%和6.52%；当分别用80 ?g/mL的EPA和DHA作用于HepG2细胞48 h后，细胞的凋亡率分别为32.12%和14.67%，且不同浓度作用下的凋亡率具有显著性差异（P<0.05）。

    2.3 n-3 PUFAs对HepG2细胞凋亡的影响

    由图3可知，不同n-3 PUFAs剂量和作用时间对HepG2细胞的数量和形态均有显著影响。对照组HepG2细胞轮廓清晰，呈梭形，细胞之间结构紧密，生长旺盛；而处理组HepG2细胞的形状发生改变，呈无规则状态，细胞的轮廓感降低，细胞浮起，细胞间距离增加、结构松散，细胞数量有所减少，死细胞增多。推测此时细胞的细胞质开始减少，细胞器发生一定程度的萎缩。凋亡细胞的核膜会发生破裂，导致胞质溶出，进而逐渐形成凋亡小体[20]。处理72 h后，HepG2细胞形态的变化更为明显，这也与MTT测定结果相吻合。

    图3中不仅可以观察到细胞凋亡早期产生的绿色荧光、坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整性的凋亡体发出的红色荧光以及坏死细胞膜内发出的绿色荧光，还可以明显观察到相应凋亡细胞形态与数量的差异性变化。由倒置荧光显微镜观察结果可知，随着n-3 PUFAs处理剂量的增大，HepG2细胞的凋亡现象更为剧烈。同时，倒置荧光显微镜清晰且直接地检测到了磷酯酰丝氨酸外翻这一细胞凋亡的重要形态特征。细胞凋亡的发生通常有多个明显的形态与生化改变，包括细胞质减少、细胞萎缩、薄膜起泡、染色质缩合、吸附力下降、细胞膜内磷脂酰丝氨酸外翻、DNA碎裂、特定位置蛋白质分解以及线粒体膜通透性增加等，而肿瘤细胞的程序性死亡减慢或者丧失能够使其逃避细胞正常生长增值的调控机制[21-23]。

    细胞增殖是多阶段、多因子参与的、受到精确而有序细胞周期调节的过程，包括细胞生长、DNA复制以及细胞分裂[24-25]。因此，抑制肿瘤细胞的增长或促进肿瘤细胞的凋亡均有利于肿瘤的治疗[20]。

    薛山[26]的研究认为，n-3 PUFAs对多种恶性疾病均有良好的预防和治疗功效，其生物学作用机制包括促脂质过氧化学说、抑制环氧合酶2和脂氧合酶的表达、抑制肿瘤血管增生、调控蛋白酶及抑制相关癌症基因编码蛋白的表达等多种理论。其中，从脂质过氧化角度来讲，n-3 PUFAs能够诱导肿瘤细胞内脂质过氧化产物（活性氧）的增加，进而直接损伤DNA、灭活功能蛋白、阻断细胞信号传导以及基因转录，从而致使细胞凋亡。Yu等[27]

    的研究表明，n-3 PUFAs能够诱导肿瘤细胞内脂质过氧化产物的积累，这可能是由于其改变了细胞中Na-K-ATP酶和5-核苷酸酶的活性以及多种抗氧化剂的水平，也可能是由于其提高了抗氧化酶类（如SOD、过氧化氢酶（catalase，CAT）等）的活力和蛋白激酶c的浓度，促进了p53的表达。通常来讲，n-3 PUFAs对脂质过氧化反应的促进作用与其所含不饱和双键的数目呈正相关，并且具有剂量依赖性。肿瘤细胞对于脂肪酸的吸收或代谢与正常细胞不同，常规剂量的n-3 PUFAs能够有选择性地抑制或杀伤肿瘤细胞，同时不损害正常细胞，这是由于肿瘤细胞中的抗氧化屏障存在缺陷，脂质过氧化产物和自由基会大量积聚，使其极易遭受过氧化损伤[28]。

    2.4 n-3 PUFAs及其单体对HepG2细胞氧化损伤的影响

    作为一种重要的营养物质，PUFAs具有广泛的生理功能和生物学活性，其在预防和治疗癌症方面扮演着越来越重要的角色，能够诱导细胞的凋亡，并在一定程度上降低癌细胞的侵袭力，但是其作用机制仍尚不明确[29]，Walther等[30]推测，肿瘤细胞的脂肪酸氧化作用可能存在缺陷。

    由图4～6可知，伊拉兔n-3 PUFAs及其单体（ALA、EPA、DPA、DHA）均能够显著上调HepG2细胞的MDA累积量和ROS的相对荧光强度水平，同时下调SOD的活力。相比之下，5 种n-3 PUFAs对HepG2细胞氧化应激影响的大小顺序为DHA>DPA>n-3 PUFAs>EPA>ALA。其中，DHA作用后HepG2细胞表现出的高水平ROS荧光强度和MDA积累量可能是由于DHA自身含有多个不饱和双键引起的，而SOD活力的下调使得ROS积累，进而对细胞造成脂质过氧化损伤。120 μmol/L的n-3 PUFAs能够通过调节细胞内的氧化应激水平以及脂质过氧化影响HepG2细胞的生长，氧化应激和脂质过氧化作用越剧烈，细胞损伤越大，对肿瘤细胞的杀伤力也就越大。曾思敏[31]的研究表明，ALA、EPA、DHA、亚油酸（linoleic acid，LA）、γ-亚麻酸（γ-linolenic acid，GLA）和花生四烯酸（arachidonic acid，AA）6 种PUFAs的添加均能促使胃癌细胞MGC、SGC中MDA积累量显著上升，SOD活性显著下降，ROS生成量大大提高，并进一步诱导MGC和SGC细胞的凋亡，而正常细胞未受到损害。王占有[19]的研究表明，n-3 PUFAs（EPA和DHA）能够通过影响细胞脂质过氧化反应来抑制HepG2细胞的增殖，并诱导其凋亡；EPA和DHA作用于细胞后，HepG2细胞中SOD的活力均有显著下降（P<0.05），且用质量浓度分别为80、100 ?g/mL的EPA或DHA处理后，细胞的SOD活力较之60 ?g/mL处理组显著降低（P<0.05），细胞的MDA沉积量均显著升高（P<0.05）。这与本研究的结果相似。结合本研究结果可知，伊拉兔肌内磷脂n-3 PUFAs诱导HepG2细胞凋亡的功效可能主要依托于DHA、DPA和EPA这3 种长链PUFAs发挥的诱导作用，n-3 PUFAs的不飽和双键越多，作用的主导性越大。因此，在伊拉兔的饲喂养殖、烹饪加工以及贮运包装中，如何提高其原料或产品中长链PUFAs的相对含量将成为兔肉营养与健康课题中值得探讨的问题。

    3 結 论

    伊拉兔肌内磷脂n-3 PUFAs在30～180 μmol/L剂量范围均能够抑制HepG2、MV3和A375肿瘤细胞系的生长，其中HepG2细胞对伊拉兔肌内磷脂n-3 PUFAs的敏感性最显著，并表现出明显的时效与量效关系。通过Annexin V-FITC和PI双染法对HepG2细胞进行凋亡检测，证实了伊拉兔肌内复合磷脂n-3 PUFAs诱导凋亡的作用。此外，ALA、EPA、DPA、DHA以及n-3 PUFAs均可以引起HepG2细胞内氧化应激的改变，通过显著上调细胞内MDA的累积量以及ROS的相对荧光强度水平，同时下调SOD的酶活力实现对HepG2细胞的诱导凋亡作用，其中DHA在非酶促氧化反应中发挥主要作用。因此，在伊拉兔肉的膳食营养课题中研究如何提高肌内磷脂中长链PUFAs，尤其是DHA的相对含量将有重要意义。

    参考文献：

    [1] FERLAY J， SHIN H R， BRAY F， et al. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008： GLOBOCAN 2008[J]. International Journal of Cancer， 2010， 127（12）： 2893-2917. DOI：10.1002/ijc.25516.

    [2] JEMAL A， BRAY F， CENTER M M， et al. Global cancer statistics[J]. CA： A Cancer Journal for Clinicians， 2011， 61（2）： 69-90. DOI：10.3322/caac.20107.

    [3] 王迎春， 王金华. ω-3多不饱和脂肪酸对肿瘤细胞侵袭转移的影响及机制研究进展[J]. 肿瘤学杂志， 2016， 22（3）： 236-241.DOI：10.11735/j.issn.1671-170X.2016.03.B017.

    [4] 刘睿杰， 王莉梅， 常明， 等. n-6/n-3多不饱和脂肪酸比例对HepG2细胞脂代谢的影响[J]. 现代食品科技， 2017， 33（1）： 1-7.DOI：10.13982/j.mfst.1673-9078.2017.1.001.

    [5] SUN Sinan， JIA Weidong， CHEN Hao， et al. Docosahexaenoic acid （DHA） induces apoptosis in human hepatocellular carcinoma cells[J]. International Journal of Clinical and Experimental Pathology， 2013， 6（2）： 281-289.

    [6] LENG X L， KINNUN J J， CAVAZOS A T， et al. All n-3 PUFA are not the same： MD simulations reveal differences in membrane organization for EPA， DHA and DPA[J]. Biochimica Et Biophysica Acta （BBA）-Biomembranes， 2018， 1860（5）： 1125-1134. DOI：10.1016/j.bbamem.2018.01.002.

    [7] 李世伟， 马怀幸， 李苏宜. ω-3多不饱和脂肪酸治疗癌性恶病质系统评价及荟萃分析[J]. 肠外与肠内营养， 2017， 24（1）： 28-32. DOI：10.16151/j.1007-810x.2017.01.008.

    [8] 戴金凤. 多不饱和脂肪酸影响胃癌细胞生长的机理[D]. 杭州： 浙江大学， 2013： 25-27.

    [9] DAI Jinfeng， SHEN Junhui， PAN Wensheng， et al. Effects of polyunsaturated fatty acids on the growth of gastric cancer cells in vitro[J]. Lipids in Health and Disease， 2013， 12： 71-86. DOI：10.1186/1476-511X-12-71.

    [10] MANDAL C C， GHOSH-CHOUDHURY T， YONEDA T， et al. Fish oil prevents breast cancer cell metastasis to bone[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2010， 402（4）： 602-607. DOI：10.1016/j.bbrc.2010.10.063.

    [11] MENG Hongzhou， SHEN Yuzhen， SHEN Junhui， et al. Effect of n-3 and n-6 unsaturated fatty acids on prostate cancer （PC-3） and prostate epithelial （RWPE-1） cells in vitro[J]. Lipids in Health and Disease， 2013， 12： 160. DOI：10.1186/1476-511X-12-160.

    [12] DELISEO D， MANZI L， MERENDINO N， et al. Docosa-hexaenoic acid inhibits invasion of human RT112 urinary bladder and PT45 pancreatic carcinoma cells via down-modulation of granzyme expression[J]. The Journal of Nutritional Biochemistry， 2012， 23（5）： 452-457. DOI：10.1016/j.jnutbio.2011.01.010.

    [13] MANNI A， XU H， WASHINGTON S， et al. The impact of fish oil on the chemopreventive efficacy of tamoxifen against development of N-methyl-N-nitrosourea-induced rat mammary carcinogenesis[J]. Cancer Prevention Research， 2010， 3（3）： 322-330. DOI：10.1158/1940-6207.CAPR-09-0173.

    [14] 韋娜. 膳食中不同n-6/n-3多不饱和脂肪酸构成对乳腺癌发生发展的影响及分子机制研究[D]. 重庆： 第三军医大学， 2006： 16-18.

    [15] XUE Shan， HE Zhifei， LI Hongjun， et al. Effect of growth on fatty acid composition of total intramuscular lipid and phospholipids in Ira rabbits[J]. Korean Journal for Food Science of Animal Resources， 2015， 35（1）： 10-18.DOI：10.5851/kosfa.2015.35.1.10.

    [16] 薛山， 贺稚非， 肖夏， 等. 冷藏期间不同加工处理后伊拉兔肉中肌内总脂肪的变化[J]. 食品科学， 2015， 36（14）： 238-243. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201514046.

    [17] XUE Shan， HE Zhifei， XIAO Xia， et al. Effect of different cooking methods on the composition and nutritional value of intramuscular fatty acids of Hyla rabbit[J]. Korean Journal for Food Science of Animal Resources， 2016， 32（2）： 170-177. DOI：10.5851/kosfa.2016.36.2.178.

    [18] 薛山， 贺稚非， 肖夏， 等. 热加工方法对伊拉兔冷藏期间肌内磷脂变化的影响[J]. 中国农业科学， 2015， 48（11）： 2241-2250. DOI：10.3864/j.issn.0578-1752.2015.11.015.

    [19] 王占有. ω-3多不饱和脂肪酸诱导人肝癌细胞HepG2凋亡及其分子机制的研究[D]. 洛阳： 河南科技大学， 2010： 2-4.

    [20] ZHANG Yu， LI Hongjun， DOU Huating， et al. Optimization of nobiletin extraction assisted by microwave from orange

    by-product using response surface methodology[J]. Food Science and Biotechnology， 2013， 22： 1-7. DOI：10.1007/s10068-013-0061-5.

    [21] HARADA S， TOMINARI T， MATSUMOTO C， et al. Nobiletin， a polymethoxy flavonoid， suppresses bone resorption by inhibiting NF κB-dependent prostaglandin E synthesis in osteoblasts and prevents bone loss due to estrogen deficiency[J]. Journal of Pharmacological Sciences， 2011， 115（1）： 89-93. DOI：10.1254/jphs.10193SC.

    [22] CHAN K T， MENG F Y， LI Q， et al. Cucurbitacin B induces apoptosis and S phase cell cycle arrest in BEL-7402 human hepatocellular carcinoma cells and is effective via oral administration[J]. Cancer Letters， 2010， 294（1）： 118-124. DOI：10.1016/j.canlet.2010.01.029.

    [23] SHEN Jiakun， DU Huaping， YANG Min， et al. Casticin induces leukemic cell death through apoptosis and mitotic catastrophe[J]. Annals of Hematology， 2009， 88（8）： 743-752. DOI：10.1007/s00277-008-0677-3.

    [24] DING C， KHAN M， ZHENG B， et al. Casticin induces apoptosis and mitotic arrest in pancreatic carcinoma PANC-1 cells[J]. African Journal of Pharmacy and Pharmacology， 2012， 6： 412-418. DOI：10.5897/AJPP11.830.

    [25] SUNAGAWA Y， YABUKI S， MURAKAMI A， et al. Nobiletin， a citrus flavonoid， prevents the worsening of heart failure in rats with myocardial infarction[J]. Journal of Cardiac Failure， 2010， 16： S170. DOI：10.1016/j.cardfail.2010.07.204.

    [26] 薛山. n-3 PUFA的抗癌功效及其生物学作用机制[J]. 中国食品添加剂， 2016（7）： 200-206. DOI：10.3969/j.issn.1006-2513.2016.07.023.

    [27] YU J H， KANG S G， JUNG U Y， et al. Effects of omega-3 fatty acids on apoptosis of human gastric epithelial cells exposed to silica-immobilized glucose oxidase[J]. Annals of the New York Academy of Sciences， 2009， 1171： 359-364. DOI：10.1111/j.1749-6632.2009.04703.x.

    [28] KURATNIK A， SENAPATI V E， VERMA R， et al. Acute sensitization of colon cancer cells to in?ammatory cytokines by prophase arrest[J]. Biochemical Pharmacology. 2012， 83（9）： 1217-1228. DOI：10.1016/j.bcp.2012.01.024.

    [29] 王莉梅， 刘睿杰， 金青哲， 等. 多不饱和脂肪酸在癌症发生中的作用机制研究进展[J]. 中国油脂， 2014， 39（8）： 37-41.

    [30] WALTHER T C， FARESE R J. Lipid droplets and cellular lipid metabolism[J]. Annual Review of Biochemistry， 2012， 81： 687-714. DOI：10.1146/annurev-biochem-061009-102430.

    [31] 曾思敏. 多不饱和脂肪酸及其联合5-FU影响胃癌细胞生长的细胞生物学研究[D]. 杭州： 浙江大学， 2014： 36-39.

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