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呋喃西林代谢物单克隆抗体及荧光免疫层析试纸条的制备

范文

郭会灿崔海波徐冬梅

摘要：为建立一种基于荧光免疫层析技术的呋喃西林代谢物的快速检测方法，采用活性酯法合成呋喃西林代谢物（氨基脲盐酸盐）（semicarbazide hydrochloride，SEM）人工抗原，并获得SEM的单克隆抗体，通过将量子点微球（quantumdot submicrobeads，QBs）与SEM偶联，得到QBs探针，制备荧光免疫层析试纸条。结果表明：SEM免疫荧光层析试纸条检测鱼肉组织的检测限为0.247 μg/L，不同添加质量浓度的回收率均在70%～120%之间，批内、批间变异系数均在15%以下，符合我国动物源食品中兽药残留检测方法相关指导文件的规定，且在2～8 ℃条件下可以保存6 个月以上，稳定性良好。

关键詞：呋喃西林代谢物;荧光免疫层析;免疫抗原;样品预处理;量子点微球

Abstract： In order to establish a rapid fluorescence immunochromatography method for the detection of semicarbazide hydrochloride （SEM） as a furacilin metabolite， SEM hapten was synthesized and conjugated to bovine serum albumin （BSA） and ovalbumin （OVA） by the active ester method， and the hapten-protein conjugates were employed to obtain anti-SEM monoclonal antibody. Meanwhile， SEM was conjugated to quantumdot microspheres， yielding a probe. Finally，?a fluorescence immunochromatography test strip was prepared. The results showed that the detection limit of the test strip for fish meat was 0.247 μg/L. The recoveries of SEM from blank fish samples spiked at different concentrations were between 70% and 120%， and within and between batches coefficients of variation （CV） were below 15%， which was in accordance with the requirements for the determination of veterinary drug residues in animal-derived foods. The test strip was stable at?2–8 ℃ for up to 6 months.

Keywords： furasciline; fluorescence immunochromatography; immunogen; sample pretreatment; quantum dot microspheresDOI：10.7506/rlyj1001-8123-20181211-229

中图分类号：TS251.7? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2019）03-0046-06

引文格式：

郭会灿，崔海波，徐冬梅. 呋喃西林代谢物单克隆抗体及荧光免疫层析试纸条的制备[J]. 肉类研究， 2019， 33（3）： 46-51. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20181211-229.? ? http：//www.rlyj.net.cn

GUO Huican， CUI Haibo， XU Dongmei. Preparation of monoclonal antibody and fluorescence immunochromatographic test strip for detecting furacilin metabolites[J]. Meat Research， 2019， 33（3）： 46-51. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20181211-229.? ? http：//www.rlyj.net.cn

呋喃西林（Nitrofural），又称呋喃新、硝基呋喃腙、呋喃星，是一种硝基呋喃类药物，是一种可以治疗牲畜疾病的合成抗菌药。动物源性食品中硝基呋喃类药物及其代谢物的残留可通过食物链传递给人类并在机体内富集，长期富集会导致毒性和致癌风险，这种危害已引起了世界各国的极大关注。美国、澳大利亚、日本、欧盟、加拿大及新加坡等国家明确规定禁止在食品工业中使用此类药物[1-2]。各国严格执行对水产中该类药物的残留检测。残留监控措施主要从监控计划、抽样、检测、结果发布和处理五方面进行把控[3]。我国农业部已将呋喃西林列入首批禁用药第235号公告[4]，相关部门在全国范围围绕畜、禽、水产品的抗生素、禁用化合物及兽药残留超标等问题开展专项整治活动，严厉打击包括硝基呋喃类在内的药物非法使用、生产和销售。

呋喃类药物及其代谢物在机体内稳定性很差，在弱酸条件下（如人类胃液的酸性条件）从蛋白质中释放出来，在机体内其代谢物与组织蛋白结合后，可以形成稳定状态的化合物[5]，其中呋喃西林在组织中结合的代谢产物滞留时间最长，相对毒性反应也最强，现在各国明令禁止其在畜牧生产活动中添加或使用，在这种大环境下对呋喃类药物及其代谢物的研究及检测对从源头遏制此类药物的滥用显得尤为重要。

目前，对呋喃西林代谢物的检测方法主要有高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法、分光光度法、免疫分析法（immunoassay，IA）等。于慧娟等[6]利用HPLC法测定水产品中呋喃唑酮的残留量，方法灵敏度高，检测限为1.0 μg/kg。

彭涛等[7]利用气相色谱-质谱联用（liquid chromatography with tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）方法同时测定动物肌肉组织中4 种呋喃类药物呋喃它酮、呋喃唑酮、呋喃妥因和呋喃西林的代谢物，呋喃它酮代谢物（5-morpholinomethyl-3-amino-2-oxalidinone，AMOZ）和呋喃唑酮代谢物（3-amino-2-oxalidinone，AOZ）的定量限均为0.1 ng/g，呋喃西林代谢物（氨基脲盐酸盐）（semicarbazide hydrochloride，SEM）和呋喃妥因代谢物（1-amino-hydantoin，AHD）均为0.5 ng/g;AMOZ和AOZ的检测限均为0.05 ng/g，SEM和AHD均为0.1 ng/g。Cooper等[8]建立了虾组织中呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-恶唑烷酮的酶联免疫分析方法，检测限为0.1 μg/kg。

色谱技术样品处理过程繁琐、耗时、成本高，而且需要经过专门训练的人员来操作复杂的设备，并且其复杂的前处理不适合筛选大批量样品[9]。作为一种快速、灵敏、特异的检测方法，荧光免疫层析方法是热门且公认的快速检测方法[10]。本研究先通过衍生化进行抗原合成，再通过细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体，对能够稳定、特异性分泌抗呋喃西林代谢物衍生物单克隆抗体的杂交瘤细胞株进行建株，使用单克隆抗体建立用于检测呋喃西林代谢物残留的荧光免疫方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 动物BALB/c小鼠购自河北医科大学。

1.1.2 药品

盐酸氨基脲（semicarbazide hydrochloride，SEM·HCl）、1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl）carbodiimide hydrochloride，EDC）、二甲基甲酰胺（N，N-dimethylformamide，DMF）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、雞卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）美国Sigma公司;N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）? ?索莱宝生物科技有限公司;邻醛基苯甲酸（2-carboxybenzaldehyde，2-CBA）、对醛基苯甲酸（4-carboxybenzaldehyde，4-CBA）阿拉丁试剂（上海）有限公司;无水甲醇?无锡亚泰联合化工有限公司。

1.2 仪器与设备722紫外-可见分光光度计上海光学仪器厂;JIDI-16R台式多用途高速冷冻离心机广州吉迪仪器有限公司;MiLLi-Q Ingegral Lo超纯水系统德国密理博公司;BS 124S电子天平赛多利斯科学仪器（北京）有限公司;T-Meter I荧光免疫分析仪河北特温特生物科技发展有限公司。1.3 方法

1.3.1 免疫抗原的制备

半抗原的合成[11]：将0.4 g 4-CBA加入到2 mL纯水中，并将DMF缓缓加入上述溶液中，边滴加边搅拌直至4-CBA完全溶解，然后缓慢加入0.5 g SEM·HCl，并在室温下反应4 h;过滤反应溶液，得到淡黄色固体，用纯水洗涤3 次，在50 ℃条件下进行干燥，得到半抗原呋喃西林衍生物CPSEM（CP（羧基苯甲醛）与SEM的衍生物）。抗原的合成：称取21 mg CPSEM溶于2 mL DMF中，缓慢加入溶有18 mg NHS的PBS缓冲液，搅拌反应5 min后，加入3 mL溶有40 mg EDC的0.01 mol/L PBS缓冲液，在室温下搅拌2 h;称取60 mg BSA溶于2 mL PBS中，然后将上述反应溶液缓慢加入，4 ℃搅拌过夜;0.01 mol/L PBS透析3 d，-20 ℃保存备用。SEM抗原合成路线图如图1所示。检测原同法制备。

1.3.2 免疫抗原的鉴定

1.3.2.1 紫外扫描法

用PBS对CPSEM和BSA进行适当稀释，测定BSA的蛋白浓度，把CPSEM-BSA稀释到与BSA相同浓度，在220～700 nm波长下扫描，参考杨立国等[12]的方法计算BSA与CPSEM的分子偶联比。

1.3.2.2 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）鉴定选择分离凝胶为12%，浓缩凝胶为5%，通过SDS-PAGE对合成物进行鉴定。

1.3.2.3 免疫法

根据李春生等[13]的方法，通过CPSEM-BSA免疫BALB/c小鼠，并进行融合实验。

1.3.3 荧光微球（quantum dot submicrobeads，QBs）标记SEM单克隆抗体

采用EDC法偶联QBs和SEM抗体[14]：将QBs用0.1 mol/L、pH 5.5的MES溶液清洗2 遍，再用0.1 mol/L、pH 5.5的MES溶液5 mL复溶，10 000 r/min离心30 min，沉淀用MES溶液重悬，加入一定量的0.01 mol/L EDC，混合反应12 h;10 000 r/min离心30 min，沉淀用0.1 mol/L的Tris-1% Casein溶液复溶，混合反应4 h;10 000 r/min离心30 min，用0.1 mol/L的Tris-1%聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）溶液复溶，制备得到将SEM抗体用QBs标记的产物，即QBs探针，4 ℃保存，备用。

1.3.4 硝化纤维素（nitrocellulose，NC）膜封闭条件的优化通过改变NC膜封闭液的各组分浓度，来降低背景干扰和假阳性率。采用筛选的封闭液浸泡NC膜，37 ℃烘干4 h，之后用划膜仪将T线和C线包被在NC膜上，37 ℃干燥3 h。干燥环境密封保存备用。

1.3.5 荧光免疫层析试纸条的组成QBs荧光免疫层析试纸条的组成如图2所示，其中QBs探针包被在结合垫上，SEM抗原作为T线、羊抗兔二抗作为C线喷涂在NC膜上。

1.3.6 样品预处理

取2 g均质鱼肉样本于50 mL离心管中，依次加入4 mL去离子水、0.5 mL 1 mol/L HCl和100 μL 2-硝基苯甲醛，充分振荡，置于60 ℃恒温水浴孵育1 h;取出后依次加入5 mL 0.1 mol/L K2HPO4、0.4 mL 1 mol/L NaOH和5 mL乙酸乙酯，充分振荡2 min，室温条件下5 000 r/min离心10 min;取出2.5 mL乙酸乙酯层（上层）到5 mL离心管中，50 ℃氮气吹干，加入1 mL正己烷溶解，加入1 mL PBS充分混合30 s;室温条件下5 000 r/min离心10 min，取50 μL下层用于分析。

1.3.7 荧光免疫层析试纸条性能测试

1.3.7.1 检测限

根据欧盟《动物源性食品中兽药残留检测方法》的规定[15]，分别测定20 份鱼肉组织空白样品，按照1.3.6节的方法处理样品，用回归方程计算样品残留浓度，用SPSS软件得出样品浓度的平均值（）和标准差（s），以+3s作为鱼肉组织的最低检测限。

1.3.7.2 准确度

通过鱼肉样本添加回收实验检测荧光免疫层析试纸条的准确度[16-18]。在空白鱼肉组织中添加不同质量浓度的待测物，按照1.3.6节的方法处理样品，重复3 次，用荧光免疫层析试纸条进行测试，在荧光免疫分析仪上读取检测结果。按照公式（1）计算回收率。

1.3.7.3 精密度

精密度實验结果用变异系数来表示[19-21]。取3 个批次的试剂盒进行批间和批内测定，批间测定：向鱼肉组织中添加2 个不同质量浓度的待测物，每个质量浓度重复测定5 次，得出和s;批内测定：向鱼肉组织中添加2 个不同质量浓度的待测物，进行重复测定，得出和s，计算变异系数，分析批内和批间精密度。按照公式（2）计算变异系数。

1.3.7.4 稳定性

将荧光免疫层析试纸条分为3 组，分别在2～8 ℃、37 ℃、-20 ℃温度条件下进行稳定性测试[22-24]。2～8 ℃条件下保存6 个月、每个月检测1 次，37 ℃和-20 ℃条件下放置6 d、每天检测1 次，测定阴性样本的测定值和回收率等参数。

1.4 数据处理采用SPSS统计软件进行数据处理，Origin制图软件绘制标准曲线。

2 结果与分析

2.1 人工合成SEM抗原的鉴定

2.1.1 紫外扫描法鉴定

由图3可知，BSA的最大吸收峰在280 nm波长处，CPSEM的最大吸收峰在275 nm波长处，BSA和CPSEM偶联后，主峰位移至285 nm波长处，出现紫外叠加，表明偶联成功。根据朗伯-比尔定律，计算出CPSEM-BSA的分子结合比为11.8∶1。同理，计算出CPSEM-OVA的分子结合比为21∶1。

2.1.2 SDS-PAGE法鉴定

由图4可知，BSA条带约在68 kDa处，CPSEM-BSA与BSA的电泳速率稍有差异，CPSEM-BSA的条带滞后，说明其分子质量较BSA有所增加，推断是BSA连接了CPSEM所致，通过紫外凝胶成像系统分析软件计算的偶联比和紫外扫描结果一致。

2.1.3 效价测定

通过间接酶联免疫吸附法测定小鼠血清效价，针对抗体和抗原特异性结合情况判断免疫是否成功。

由表1可知，人工合成的SEM抗原免疫小鼠后，效价最高达1∶512 000，特异性良好。

2.2 NC膜封闭条件的优化结果

封闭液目的在于封闭多余的结合位点，阻断金标抗体在NC膜上的非特异性结合，保持背景的干净，突出检测线的颜色[25-26]。由表2可知，采用封闭液1封闭后，显色明显，且无背景颜色，说明封闭液1封闭效果很好。采用封闭液3封闭后，得到的检测线颜色虽然很深、很明显，但增加了一定的背景颜色，降低了检测线相对于背景的反差。封闭液4和5的背景颜色浅，但是检测线颜色浅，显色效果不明显。因此，选择封闭液1进行封闭。

2.3 SEM荧光免疫层析试纸条的性能测试结果

2.3.1 标准曲线的建立

标准曲线方程为y=-1.444 5x+1.485 5（R?=0.992 9），线性关系良好。测定20 份空白鱼肉组织样品的平均值为0.154 μg/L，标准差为0.031 μg/L，鱼肉组织的检测限为0.247 μg/L。

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