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全蝎白术白头翁组合发酵品不同醇浓度提取物的活性成分分析及体外药理研究

范文

刘金虎赵翠燕孙志艺王宇陈宏飞方园

摘 ?????要：评价全蝎白术白头翁组合发酵品（SAPZFP）不同醇浓度提取物的活性成分含量及体外抗肿瘤活性差异。分别测定SAPZFP不同醇浓度提取物的醇溶性总蛋白、总多糖、总黄酮的含量，并采用MTT法检测不同醇浓度提取物抑制肿瘤细胞体外增殖的能力。SAPZFP不同醇浓度提取物均具有体外抗肿瘤活性，其中75%醇提物抑制乳腺癌细胞株MCF-7、肺腺癌细胞株A549体外增殖的能力最强，IC50分别为0.066、0.022 mg·mL-1。综上所述，SAPZFP的25%、50%、75%醇提物均具有体外抗肿瘤活性，且75%醇提物效果最优。

关 ?键 ?词：SAPZFP;双向固体发酵;醇溶性活性成分;A549;MCF-7;抗肿瘤

中图分类号：R285.5 ??????文献标识码： A ??????文章编号： 1671-0460（2019）06-1170-04

Abstract： To evaluate the differences in the content of active constituents and anti-tumor activity in vitro of SAPZFPs different alcohol concentration extracts， the contents of alcohol-soluble total protein， total polysaccharide and total flavonoids in SAPZFPs different alcohol concentration extracts were determined， and MTT assay was used to detect the inhibitory effect of different alcohol concentration extracts on the proliferation of cancer cells in vitro. SAPZFPs different alcohol concentration extracts all showed anti-tumor activity in vitro， 75% alcohol concentration extract had the strongest inhibitory effect on the proliferation of mammary cancer cells strain MCF-7 and lung adenocarcinoma cells strain A549 in vitro. In summary， the 25%， 50% and 75% alcohol extracts of SAPZFP had anti-tumor activity in vitro， and the 75% alcohol extract had the best effect.

Key words： SAPZFP; Bidirectional solid fermentation; Alcohol-soluble active constituents; A549; MCF-7; Anti-tumor

球孢白僵菌（B.bassiana）是丛梗孢科（Moniliaceae）白僵菌属（Beauveria spp.）的丝状真菌，现代研究表明，该菌的次生代谢产物具有诱导细胞程序性死亡以及抗肿瘤的作用[1]。我国名贵的传统中药白僵蚕，便是家蚕幼虫经白僵菌感染僵化致死而得到的干燥全虫，具有极高的药用价值。随着微生物发酵技术的进步，真菌药物得到发展，中药一类新药槐耳菌质与槐耳冲剂便是药用真菌固体发酵工程的代表产物[2]。本课题组根据双向固体发酵技术，以全蝎、白术、白头翁三味中药作为药性基质，以球孢白僵菌作为发酵菌株，制备全蝎白术白头翁组合发酵品（SAPZFP）。前期研究表明，SAPZFP超声水提液与未发酵品超声水提液相比，具有更显著的体外抗肿瘤活性。对于成分复杂的中药来说，不同溶剂提取液的物质基础、药理活性与药物安全性有很大差别[3]。故本实验通过醇溶性总蛋白、总多糖、总黄酮的含量测定及MTT法检验细胞增殖的实验，对SAPZFP不同醇浓度提取物的活性成分含量及体外抗肿瘤活性进行比较，确定更具药理活性的SAPZFP提取方法，为后续研究奠定基础。

1 ?实验部分

1.1 ?仪器

FA1204B型电子天平（上海天美天平仪器有限公司）;PHS-25型pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）;SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）;KQ-500GVDV型双频恒温数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）;LGJ-18型冷冻干燥机（北京四环科学仪器厂有限公司）;ST16R型高速冷冻离心机（赛默飞世尔科技有限公司）;UV9100B型紫外可见分光光度计（北京莱伯泰科仪器有限公司）;YRE-201D型旋转蒸发器（巩义市予华仪器有限责任公司）;HERACELL 150i型CO2培养箱（赛默飞世尔科技有限公司）;生物安全柜（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）;CKX41型奥林巴斯显微镜（Made in Philippines）;DNM-9602型酶标分析仪（北京普朗新技术有限公司）等。

1.2 ?试剂

芦丁标准品（成都曼斯特生物技术有限公司）;牛血清蛋白（上海伯奥生物科技有限公司）;PBS（1×）pH7.2（SparkJade）;RPMI Medium 1640培养基（gibco）;胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司）;胰酶细胞消化液（酚红，biosharp）;MTT（BioFROXX赛国生物科技）;福林酚（上海源葉生物科技有限公司）;二甲基亚砜，无水葡萄糖，亚硝酸钠，六水氯化铝，氢氧化钠，苯酚，硫酸，硫酸铜，酒石酸钾钠等均为国产分析纯。

1.3 ?药材与细胞株

全蝎购自山东省临沂市，经山东中医药大学生药系李峰教授鉴定为钳蝎科动物东亚钳蝎（Buthus martensii Karsch）;白术为菊科植物白术（Atractylodes macrocephala Koidz）的干燥根茎、白头翁为毛茛科植物白头翁（Pulsatilla chinensis （Bge.） Regel）的干燥根，均购自河北省安国东方药城，经山东中医药大学生药系李峰教授鉴定符合《中华人民共和国药典》（2015年版）要求;球孢白僵菌桃5活化菌种（Beauveria bassiana （Bals.） Vuill）由山东省农业科学院植物保护研究所提供;乳腺癌细胞株MCF-7及肺腺癌细胞株A549均由山东省立医院提供。

2 ?实验方法

2.1 ?SAPZFP的制备

精密称定经钴 - 60灭菌的全蝎冻干粉[4]、白术粗粉、白头翁粗粉各10.00 g，加入用无菌水稀释至1×108个孢子·mL-1的二代球孢白僵菌桃5活化菌种（Beauveria bassiana （Bals.） Vuill）的孢子悬液，搅拌均匀，使湿度适宜，于光照自然、温度25 ℃、湿度大于95%的条件下，约培养7 d，待菌丝长满后适时取出，冷冻干燥即得SAPZFP，并低温密封保存。

2.2 ?SAPZFP不同醇浓度提取物的制备

2.2.1 ?SAPZFP不同醇浓度提取液的制备

取“2.1”项中SAPZFP约0.5 g，精密称定，置于100 mL具塞锥形瓶中，精密加入体积分数为25%的乙醇溶液20 mL，调节pH值为9，于频率80 kHz、输入功率500 W的条件下，40 ℃恒温超声提取50 min后，在4 000 r·min-1、4 ℃条件下离心15 min，将上清液用中速滤纸抽滤后，重复提取一次，两次滤液合并，用蒸馏水定容至100 mL，即得SAPZFP的25%醇提液（每个条件做2个平行样）。SAPZFP的50%及75%醇提液同法制备。

2.2.2 ?SAPZFP不同醇浓度提取物冻干粉的制备

按“2.2.1”项中方法制备SAPZFP的25%、50%、75%醇提液，于40 ℃恒温旋蒸至无醇味，经-18 ℃低温冻结后，置于-60℃冷阱中预冻4 h。将预冻好的各醇提液置于冷阱腔上方冻干架，在真空度<10 Pa，冷阱温度-60 ℃的条件下，真空干燥至物料温度与室温相同，即得SAPZFP的25%、50%、75%醇提物冻干粉。

2.3 ?SAPZFP不同醇浓度提取液的含量测定

2.3.1 ?醇溶性总蛋白的含量测定

采用Lowry法[5]进行SAPZFP不同醇浓度提取液醇溶性总蛋白的含量测定，以吸光度A1为纵坐标、牛血清蛋白质量浓度C1（mg·mL-1）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为A1=2.502 4C1+0.009 7（R2=0.998 4），质量浓度在0～0.2 mg·mL-1范围内呈现良好线性关系。分别取“2.2.1”项中SAPZFP不同醇浓度提取液1 mL，置10 mL容量瓶，用蒸馏水定容至刻度线，得SAPZFP不同醇浓度提取液的供试品溶液，精密量取1 mL，进行测定，根据标准曲线方程计算出醇溶性总蛋白的含量，各醇浓度提取液的供试品溶液平行测定3次。

2.3.2 ?醇溶性总多糖的含量测定

采用苯酚 - 硫酸法[6]进行SAPZFP不同醇浓度提取液醇溶性总多糖的含量测定，以吸光度A2为纵坐标、葡萄糖质量浓度C2（mg·mL -1）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为A2=15.149C2+0.004 7（R2=0.999 1），質量浓度在0～0.05 mg·mL-1范围内呈现良好线性关系。分别取“2.2.1”项中SAPZFP不同醇浓度提取液3 mL，置50 mL容量瓶，用蒸馏水定容至刻度线，得SAPZFP不同醇浓度提取液的供试品溶液，精密量取2 mL，进行测定，根据标准曲线方程计算出醇溶性总多糖的含量，各醇浓度提取液的供试品溶液平行测定3次。

2.3.3 ?醇溶性总黄酮的含量测定

采用NaNO2-AlCl3-NaOH比色法[7]进行SAPZFP不同醇浓度提取液醇溶性总黄酮的含量测定，以吸光度A3为纵坐标、芦丁质量浓度C3 （mg·mL -1）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为A3=5.505 3C3-0.000 6（R2=0.999 6），质量浓度在0～0.2 mg·mL-1范围内呈现良好线性关系。分别取“2.2.1”项中SAPZFP不同醇浓度提取液3 mL，置25 mL具塞试管中，补加体积分数为30%的乙醇溶液至5 mL，进行测定，根据标准曲线方程计算出醇溶性总黄酮的含量，各醇浓度提取液的供试品溶液平行测定3次。

2.4 ?不同醇浓度提取物冻干粉的体外抗肿瘤研究

2.4.1 ?肿瘤细胞的复苏与培养

将冻存在-80 ℃超低温冰箱中的乳腺癌细胞株MCF-7、肺腺癌细胞株A549快速融化，并用常规方法复苏。乳腺癌细胞株MCF-7、肺腺癌细胞株A549均加入含有10%胎牛血清的RPMI Medium 1640培养基，置于37 ℃、5%CO2的条件下静置培养。适时观察细胞状态和培养基的变化情况，及时换液，待培养瓶中细胞融合度达到80%～90%时，用胰蛋白酶消化法，按1：2的比例进行传代。

2.4.2 ?不同醇浓度提取物冻干粉溶液的配制

取“2.2.2”项中SAPZFP不同醇浓度提取物冻干粉各约10 mg，精密称定，用无血清RPMI Medium 1640培养基配成2 mg·mL-1的初始药物浓度，在超净工作台中，用0.22 μm的针式无菌过滤器滤过后，依次用无血清RPMI Medium 1640培养基2倍稀释，得1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 mg·mL-1的SAPZFP不同醇浓度提取物冻干粉溶液，用于下述体外抗肿瘤研究。

2.4.3 ?MTT法检测不同醇浓度提取物抑制肿瘤细胞体外增殖的能力

取对数生长期的乳腺癌细胞株MCF-7，用常规方法进行消化，加入无血清RPMI Medium 1640培养基，制成密度为1×105个细胞·mL-1的单细胞悬液，每孔100 μL接种于96孔细胞培养板（每个板预留5个调零孔）。于37℃、5%CO2的条件下静置培养，使细胞贴壁生长，24 h后，弃去上清液，加药组每孔加入“2.4.2”项中不同醇浓度提取物冻干粉配制的不同浓度药物溶液100 μL（每个浓度设置5个复孔），同时配制阴性对照组、100 μg·mL-1的顺铂阳性对照组。继续常规培养24 h后，每孔在避光条件下加入MTT溶液（5 mg·mL-1）20 μL，继续培养4 h后，弃去上清液，每孔加入100 μL的DMSO溶液，37 ℃恒温震荡混匀后，选择492 nm波长进行比色，根据各孔的吸光度（OD）值，按下式计算细胞增殖抑制率。

抑制率（%）=[1-（加药组OD值 - 调零组OD值）/（阴性对照组OD值 - 调零组OD值）]×100%

同法检测药物抑制肺腺癌细胞株A549体外增殖的能力。

2.5 ?数据处理

所有数据均采用Microsoft Excel （Office 2010）整合，并通过SPSS 17.0中Logit模型计算IC50。

3 ?结果

3.1 ?SAPZFP不同醇浓度提取物的活性成分分析

SAPZFP不同醇浓度提取物的活性成分含量见表1。在试验浓度范围内，SAPZFP的25%醇提物的各活性成分含量最高，随着乙醇浓度的增加，醇溶性总蛋白、醇溶性总多糖、醇溶性总黄酮的含量依次降低。

3.2 ?SAPZFP不同醇浓度提取物的体外抗肿瘤研究

3.2.1 ?SAPZFP不同醇浓度提取物对乳腺癌细胞株MCF-7的抑制作用

SAPZFP不同醇浓度提取物对乳腺癌细胞株MCF-7的抑制作用见表2。

在各试验药物浓度下，SAPZFP不同醇浓度提取物均对乳腺癌细胞株MCF-7有抑制作用，SAPZFP的25%醇提物、50%醇提物、75%醇提物对乳腺癌细胞株MCF-7的IC50分别为0.183、0.092、0.066 mg·mL-1。

3.2.2 ?SAPZFP不同醇浓度提取物对肺腺癌细胞株A549的抑制作用（表3）

在各试验药物浓度下，SAPZFP不同醇浓度提取物均对肺腺癌细胞株A549有抑制作用，SAPZFP的25%醇提物、50%醇提物、75%醇提物对肺腺癌细胞株A549的IC50分别为0.042、0.040、0.022 mg·mL-1。

4 ?结论

利用药用真菌的分解转化能力对中药及其复方进行发酵炮制，可以增强药效，增加安全性，扩大适应症。药用真菌双向固体发酵是以具有活性成分的中药及其复方作为药性基质，以药用真菌作为发酵菌株的现代固体发酵[2]。一方面，药性基质能提供药用真菌生长所需要的营养物质，同时，药用真菌的生长代谢过程也可以产生极具生理活性的次生代谢产物以及几十种胞外酶，这种强大的酶系能对药性基质的细胞进行破壁，加速有效成分的溶出，并能够对药性基质进行结构修饰和生物转化，进而形成新的活性成分或改变各组分间的相互比例;另一方面，药用真菌作为传统中药的一部分，疗效确切，安全性较高，通过发酵有可能将药性基质中的有毒成分分解转化，从而在一定程度上增加中药及其复方的安全性[8]。

本文研究表明：SAPZFP不同醇浓度提取物中，25%醇提物的醇溶性总蛋白、总多糖、总黄酮的含量最高;在体外抗肿瘤研究中，75%醇提物抑制乳腺癌细胞株MCF-7、肺腺癌细胞株A549的体外增殖能力最强，其IC50分别为0.066、0.022 mg·mL-1。由此可见，SAPZFP不同方法提取物的有效成分与药理活性均存在差异，其中75%醇提物具有更好的体外抗肿瘤活性，本实验结果为后续深入研究奠定了基础。

参考文献：

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[3] 李品，王琦，彭莉，等.痔血胶囊水提物和醇提物对大鼠肝毒性的影响[J].中国实验方剂学杂志，2017，23（08）：154-159.

[4] 孙静，王集会.全蝎三种产地加工方法的对比研究[J].中国现代中药，2016，18（07）：903-906.

[5] 曹广超，刘金虎，田志龙，等.超声法提取虻虫水溶性蛋白质的工艺研究[J].当代化工，2018，47（05）：886-889.

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[7] 曹广超，王舒玉，王彦多，等.正交试验法优选发酵蜣螂粉中总黄酮的提取工艺[J].华西药学杂志，2018，33（03）：305-308.

[8] 李津，宋强.药用真菌发酵中药及复方的可行性分析[J].辽宁中医杂志，2014，41（01）：48-49.

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