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标题

黑曲霉柠檬酸生产菌常用的保藏方法

范文

刘梦涵叶海强李黎明

摘 ? ? ?要：菌种保藏一般出于两种情况，一是为了随时供生产应用，要求菌种经常处于活化状态，通常保存的是斜面菌种;另一种是为了长期保存，要求菌种处于休眠状态，一般采用沙土管、石蜡封存存发和真空冷冻干燥法。介绍了黑曲霉生产菌常用的保藏方法即斜面低温保藏法和沙土管保藏方法。该方法制作简单，操作方便，菌种活力高。

关 ?键 ?词：黑曲霉孢子;保藏;沙土管

中图分类号：TQ 016.1 ? ? ? 文献标识码： A ? ? ? 文章编号： 1671-0460（2019）12-2804-04

Abstract： The preservation of bacteria species is generally based on two conditions. One is that the bacteria species are in activated state for production and application at any time; The other is that the bacteria species are in dormant state for long-term preservation. Generally， sand pipe， paraffin wax storage and vacuum freeze drying method are adopted for long-term preservation. In this paper， the common storage methods of aspergillus nigra producing bacteria were introduced in detail， namely inclined plane low temperature storage method and sand pipe storage method. The methods are simple， easy to operate and can maintain high bacterial activity.

Key words： Aspergillus niger spores; Preservation; Sand tube

受外界环境的影响，微生物经常发生小几率的变异，这种变异会导致菌种生产性状的劣化或自身的死亡。要使生产菌株在反复使用过程中，保持高产菌株的特征，在做好菌种选育的同时，菌种保藏工作必须同步进行。

在生产和培养过程中，菌种会衰退，纯度会下降，为了提高菌种的存活率，减少菌种的变异，尽量使菌种保持原有的优良生产性状菌种，为此必须创造一个合适的休眠环境条件，即干燥、低温、缺氧和缺乏养料等条件，使菌种代谢活动处于最低的状态，使菌种保持活力，但又不至于死亡，从而达到保藏的目的。

菌种保藏应根据保藏要求，即短期、中期、长期保藏，以及黑曲霉柠檬酸生产菌的特点选用合适的方法。鉴于黑曲霉能生成大量的分生孢子，一般选用保藏孢子的方法进行保藏。生产上目前常用的保藏方法主要有斜面保藏法、沙土管保藏法、真空冷冻干燥保藏法[1]。

斜面保藏法是生产中普遍采用的一种保藏方法，即菌种孢子移接于土豆汁琼脂斜面后，于35 ℃下培养4～5 d，待长满黑褐色孢子后，放置在4 ℃冰箱中保存，此法可保藏1～2个月。但缺点是菌株在4 ℃环境条件下，培养基又提供一定的营养条件，菌种仍有一定的代谢强度，因此在这种恶劣的条件下，菌种容易产生变异，故不宜长时间保藏菌种[2]。

沙土管保藏的原理是将孢子吸附在沙土载体上，进行干燥保藏。即以斜面健壮的分生孢子拌入处理后的无菌沙土中，放置4 ℃低溫冰箱中保存。由于沙土管兼具低温、干燥，且隔绝空气，保藏菌种效果较好，制作又简单，比液体石蜡法好，因此这是生产常用的长期保藏菌种的方法，保藏时间至少2～10 a。

1 ?实验部分

1.1 ?PDA培养基配制

1.1.1 ?土豆汁的制作方法

取新鲜土豆去皮，切成小丁。取200 g土豆丁加入1 000 mL蒸餾水煮沸，煮沸后500 W維持30 min，4层纱布过滤，然后再用蒸馏水冲洗土豆丁，冷却后将土豆汁定容至1 000 mL。

1.1.2 ?无菌空平皿准备

事先将需要用的空平皿在恒温鼓风干燥箱中干热灭菌（180 ℃， 2～3 h），或用高压蒸汽锅灭菌20 min（0.1～0.13 MPa、121～123 ℃），无菌空平皿送入无菌室内待用。

1.1.3 ?PDA平板配制

按照2%葡萄糖，1.8%琼脂添加量加入土豆汁中，水浴锅内溶解，待琼脂完全溶解后，分装三角瓶内。将装有培养基的三角瓶送入高压蒸汽灭菌121 ℃×20 min。灭菌结束后取出冷却至50 ℃左右，在洁净、无气流循环的台面上倒平板，待平板内培养基冷却凝固，放入37 ℃恒温培养箱中空白培养48 h，检查有无染菌后，备用。

1.1.4 ?PDA小斜面配制

按照2%葡萄糖，1.8%琼脂添加量加入土豆汁中，水浴锅内溶解，待琼脂完全溶解后，分装18×180试管中，每个试管培养基体积约4～5 mL。塞上棉赛，包扎牛皮纸后，送入高压蒸汽灭菌121 ℃×20 min。灭菌结束后取出冷却至50 ℃左右，在洁净、无气流循环的略有倾斜度的台面上摆放斜面，待斜面培养基冷却凝固，放入37 ℃恒温培养箱中空白培养48 h，检查有无染菌后，备用。

1.2 ?沙土管制备

（1）取淮河边的沙子，80 ℃烘干，烘干后用60目筛子，筛去大颗粒的粗砂及小石子，再用80目筛子去除小颗粒沙子及细土，分装烧杯备用。

（2）取地面下40～60 cm非耕作层不含腐植质的瘦黄土或红土，一般从河边取。烘干、碾碎后过筛，即先用60目筛子，筛去大颗粒土及石子，再用80目筛子去除小颗粒细土，分装烧杯备用。

（3）将过筛后的合格的沙、土用1 N稀盐酸，煮沸30 min，浸泡24 h，以去除其中的有机质，由于淮河边，河沙中有机质较多，再用20%盐酸浸泡24 h。

（4）倒去酸水，用蒸馏水浸泡，并反复冲洗至，用试纸测试pH为中性即可。注意，由于土比重较轻，容易随倒出的水流走，所以洗泡土时，一定要待土完全沉淀后，才可轻轻的倒水。

（5）再用1 N氢氧化钠浸泡24 h，倒去碱水，用蒸馏水水浸泡并反复冲洗至中性，可用试纸测试。

（6）浸泡后的沙、土放置与80 ℃烘箱内烘干，再用40目筛子过筛，以去掉粗颗粒，备用。

（7）按沙∶土=2∶1掺合均匀，分装入18 mm×180 mm的小试管中，每管装2 g左右，塞上棉塞，灭菌，烘干备用。

（8）抽样进行无菌检查，按照10%比例抽查沙土管。将10 mL无菌生理盐水倒入沙土管内，充分摇匀，震荡约5 min后，涂布细菌、PDA平板，每板涂布0.2 mL。平板置于36 ℃培养基箱中培养48 h，观察是否有杂菌，若平板无杂菌，则沙土管合格，可以使用;若平板有杂菌，则沙土管继续灭菌2～3次，再次抽查，直至平板培养无杂菌方为合格。

1.3 ?高产菌种选育

1.3.1 ?分离用品制备

1 mL吸管若干支（封口塞上少許棉花）、分别用牛皮纸包扎好;φ90 mm玻璃漏斗一只、塞上少许脱脂棉花，放在一只空的250 mL三角瓶上，用纱布和牛皮纸包扎好;将分散孢子用的玻璃珠约30粒装入一只250 mL三角瓶内，配制0.85%的生理盐水100、50 mL，塞上棉塞包扎好防水牛皮纸。以上物品送入高压蒸汽灭菌锅内（0.1～0.13 MPa、121～123 ℃）灭菌30 min，送入无菌室待用。

1.3.2 ?菌种分离

（1）菌种

供试验菌种：黑曲霉（Aspergillus niger）Co827，菌种保藏号：CICC 40347，由中粮生物化学（安徽）股份有限公司提供。

玉米粉、a-淀粉酶（耐高温）、糖化酶等均由中粮生物化学（安徽）股份有限公司提供。

（2）设备与仪器

恒温水浴锅;温度计、搅拌器、电炉; NBS INNOVER43?摇床、1 000 mL烧杯、250 mL三角瓶。

将生产用的斜面菌种制作成一定浓度的孢子悬浮液，涂布在PDA平板上，培养24 h，在无菌净化台上挑选菌落凸起，大小中等，不发散的菌落转移至小斜面上进行产孢，待斜面孢子培养成熟后进行摇瓶筛选。本次平板分离共挑选28个单菌落。

1.3.3 ?摇瓶筛选

（1）摇瓶培养基配置

25%玉米粉调浆，按照2%比列添加α-淀粉酶，稍做几次搅拌放在水浴锅中，95 ℃条件下液化，用碘液检测无淀粉反应即液化完全[3-5]。留取一定量的液化液后，其余的用滤布过滤出清液，将液化液、液化清液按照一定比例混合，分装摇瓶40 mL/瓶，不补水。灭菌121 ℃×20 min。

（2）摇瓶初筛

挑选的28个单菌落，利用挖取菌块的方法接入摇瓶培养基内进行摇瓶初筛，摇瓶发酵条件：35 ℃，400 r/min。发酵72 h。摇瓶发酵结果如表1。

根据摇瓶初筛发酵产酸、转化率结果，优选1#、3#、13#、14#、15#、16#六株菌株进入复筛。

（3）摇瓶复筛

进入复筛的六株菌株，利用划线法传代斜面培养，35 ℃条件下，培养5 d。将培养成熟的斜面孢子做成孢子悬浮液，稀释一定梯度，涂布PDA平板，培养24 h，菌落计数。这样得到孢子悬浮液的浓度。然后按照一定的30万/mL接种量接入配制好的摇瓶培养基中摇瓶发酵，根据发酵终点产酸，优选一株产酸高的菌株作为保藏的出发菌株。

根据摇瓶复筛发酵结果，优选一株菌球形态成菊花状，松散适宜的、产酸高的菌株作为保藏菌株的出发菌株。

2 ?结果与分析

2.1 ?发酵结果判断

35 ℃，400 r/min条件下，摇瓶发酵72 h。酸度检测、镜检。

2.1.1 ?酸度的滴定

（1）原理

柠檬酸与氢氧化钠发生酸碱中和反应，用酚酞指示剂指示终点，溶液颜色由无色变成粉红色，即为滴定终点。

（2）主要试剂和溶液

（a） 0.142 9 mol/L标准氢氧化钠溶液

（b） 0.5%酚酞指示剂。

（3）主要仪器和设备

漏斗，试管，三角瓶（250 mL），吸管（1 mL），碱式滴定管（25 mL或50 mL）。

（4）测定步骤

取1 mL发酵液于250 mL的锥形瓶，加适量蒸馏水，加1～2滴酚酞指示剂，用0.142 9 mol/L标准氢氧化钠溶液滴定至粉红色。

（5）计算

所消耗的氢氧化钠毫升数即为该溶液的柠檬酸酸度（w/v%）。

2.1.2 ?镜检

分别用60倍、150倍、600倍倍数下观察菌球的整体形态、菌丝粗壮情况，并记录下菌球的大小、松散度、菌丝长度以及有无杂菌、断丝等。

2.2 ?高产菌株确定

结合摇瓶产酸及菌球形态，优选13#株产酸作为保藏菌株的出发菌。

2.3 ?斜面菌种制作

在无菌净化工作台上，利用划线法，将出发菌的孢子传至合格的空白斜面上，35 ℃，培养4～5 d。

2.4 ?菌种保藏

2.4.1 ?斜面保藏

将上述培养成熟菌株，放置干燥器内，4 ℃冰箱保藏即可。

2.4.2 ?沙土管保藏

（1）沙土管菌种保藏

无菌净化台上，将接种环在火焰下灭菌后冷却，取上述斜面培养基上长好的孢子接入到无菌的砂土管中（注意勿把培养基带入）搅匀，塞紧塞子，置于盛有干燥剂的容器中，密封、低温保藏即可。

（2）沙土管保藏检查

（a）每10支抽取一支，在无菌条件下，用接种环取出少量沙土粒，划线于斜面培养基上，进行培养，观察菌台生长情况和产孢情况。

（b）35 ℃，培养24 h，观察斜面生长情况。如果斜面出现杂菌或菌落数很少或基本不长，这说明制备的沙土管不合格，需重新制备。

（c）若经检查没有问题，放冰箱或室内干燥处保存。每半年检查一次活力和杂菌情况。用此方法，通常可以保藏2～10 a时间不等[4]。

3 ?结果与讨论

菌种保藏的方法很多，但总体上原理是一致的，即挑选优良的纯的种子，最好是他们的休眠體（如芽孢、分生孢子等），外界创造一个使微生物代谢不活泼，生长受抑制的环境条件，如干燥、低温、缺氧及缺乏营养（营养受限）、添加保护剂等，使保藏中的微生物不进行增值，也就很少发生突变[4]。

在微生物实验室和生产、应用单位，保持菌种优良的性状长期不衰退是一项重要而艰巨的工作。变异是生物的客观规律，群体中突变细胞的生长优势和个别细胞的自发突变是菌种退化的重要原因，传代次数的增加和不适宜的培养条件是加速菌种退化的重要因素。控制传代次数、创造良好的培养条件、利用性状稳定的细胞进行传代和采用有效的菌种保藏方法是防止菌种退化的有效措施[4]。在诸多的菌种保藏方法中，斜面保藏和沙土管保藏是目前生产常用的简单、快捷的黑曲霉菌种保藏方法。

4 ?结论

本文主要提供了两种用于黑曲霉柠檬酸生产菌的常用保藏方法，根据不同需要，分别采用不同的保藏方法。斜面保藏法适用于短期保藏，保藏时间一般为1～2月，沙土管保藏适用于长期保藏，保藏时间为2～10 a[4]。

参考文献：

[1]诸葛健，李华钟. 微生物学[M]. 北京：科学出版社，2004-09.

[2]王博彦，金其荣. 发酵有机酸生产与应用手册[M].北京：中国轻工业出版社，2000-01： 124-149.

[3] 陈儆，王立才，王彦波. 玉米淀粉工业手册[M].北京：中国轻工业出版社， 2009-09.

[4] 檀耀辉，诸葛建，等. 微生物学[M]. 北京：轻工业出版社，1990-05.

[5] 卢宗梅，周勇，杨儒文，等. 全清液发酵营养组学的精准控制[J].当代化工， 2019（4）.

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