| 标题 | 浅析DNA条形码技术在中药溯源中的应用 |
| 范文 | 杜兴丽 施明毅 摘要：中药质量安全问题直接关系到中医药的发展，中药材从种植到使用的整个环节中，都需要严格把控。中药溯源建设的目的在于让中药材流通环节透明化，把控质量关口，让消费者放心用药。通过文献查阅，学习中药溯源新的研究成果，探讨在溯源体系中，如何使用DNA条形码技术快速方便地进行中药材真伪的鉴定，并做浅显的讨论。文中所提到的DNA条形码技术是质量控制方法中的一种，此方法能够方便准确的检测动植物药材的真伪优劣。 关键词：DNA条形码技术；中药溯源；质量安全 中图分类号：TP391 文献标识码：A 文章编号：1009-3044（2019）12-0238-04 开放科学（资源服务）标识码（OSID）： Application of DNA Barcode Technology in Traceability of Traditional Chinese Medicine DU Xing-li， SHI Ming-yi （Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137， China） Abstract： The quality and safety of traditional Chinese medicine is directly related to the development of traditional Chinese medicine. The whole process of cultivation and use of traditional Chinese medicine requires strict control. The purpose of traceability construction of traditional Chinese medicine is to make the circulation of traditional Chinese medicine transparent， to control the quality of the pass， and to reassure consumers of medication. By consulting the literature and learning the new research results of TCM traceability， this paper explores how to use DNA barcode technology to quickly and conveniently identify the authenticity of TCM in the traceability system， and makes a simple discussion. The DNA barcode technology mentioned in this paper is one of the quality control methods， which can conveniently and accurately detect the quality of animal and plant medicinal materials. Key words： DNA barcoding； traceability of traditional Chinese medicine； quality safety 從我国近些年来所监测到的药品不良反应报告来看，中药不良反应约占17.3%[1]，观近代中药材市场，存在许多影响药材质量的行为，在种植环节有种子种源出现差错，采摘部位，时间等出现问题；在加工环节，存在人为的不按操作方法操作，或人为的掺杂、掺假等行为，在运输环节，运输装卸不规范，导致药材走油、霉变等现象[2]，在销售环节，商家为了牟利，而故意以次充好等劣迹。以上所述问题使得中药材从治病之药材，转变成了致病的药材，严重的贻误了患者的病情，甚至可能危害人们的生命。 中药溯源体系建立的主要目的是实现药材流通过程的追踪，监控中药材各个环节的操作过程，加强中药材安全质量管理，实现中药材的来源、去向、责任的追究督查，为中药材的监管加上保险锁。在此过程中，中药材真伪鉴定环节需要依靠诸多的中药质量鉴定方法，如：形态性状鉴定、化学成分鉴定、分子生物学鉴定、DNA条形码技术等，其中，DNA条形码技术能够在无法了解到药材完整信息的情况下，区分药材的种类。 1 中药溯源体系 1.1 中药溯源体系建设背景 中医治病救人的关键在于“医”和“药”的结合，中药材是重要的组成部分，保证中药材的安全，让消费者放心是拓展中医中药发展的关键因素之一。在互联网迅速席卷各行各业的时代，传统的中药行业也不例外，中医药行业O2O模式[3]的兴起，让该行业有了新的发展方向。同服装行业和电子产品行业一样，中药材也兴起了网络销售的模式。网络销售方式（如：淘宝等店铺销售、大型公司网站销售、微信销售等）节省了中药材流通成本，然网络方便商家与消费者的同时，也让中药材的质量更加难以鉴别。 在网络售卖的环境下，消费者很难在发现中药材出现质量问题后，合理有效的维权，而因中药材的质量问题影响病人的病情，或者使患者病情更加危重的现象，也有发生。同时，越来越多的假冒伪劣产品，让中药市场出现混乱，让消费者无法放心，使医患关系更难处理。 溯源体系的研究始于2002年，相比于国外在13世纪就有对天鹅的追踪的记录[4]，我国的溯源体系研究发展较晚，并首先应用于食品行业。在2011年4月，“中药溯源”被纳入商务部《全国药品流通行业发展纲要（2011-2015）信息监测及标准体系》，可见国家对中药溯源建设的重视。整个溯源体系所涉及的关键技术有标识技术、追溯码编码技术、可追溯信息平台数据同步技术、智能终端技术等[5]，这些技术的协同作用，才能实现完整的中药溯源过程。2014年，国家商务部在和财政部决定支持9个省的中药材流通溯源体系建设。2017年7月1日实施的《中华人民共和国中医药法》中，提出要加强中药材质量的监控，支持建立中药材流通追溯体系。在持续深入的研究后，为解决中药溯源过程中主体分散，难以管理[6]，提出了将区块链技术运用到溯源体系的研究尝试。医药安全关乎民生，保证中药材的质量，中医治病才能疗效显著。 1.2 中药溯源系统简介 中药溯源系统集合了现代物联网技术，整个系统贯穿“中药种植、饮片加工、流通使用”等环节[7]，通过现代Internet网络，以数据的方式，构建一个追踪的平台，此平台包含了中药材的种植、加工以及销售使用。成都中医药大学在2016年提出的中药材种植溯源系统包括了监控子系统、种植子系统与查询子系统（如图1）[8]；在2017年，提出了中药饮片溯源生产管理系统及方法，此方法包括了生产加工单元、质量检查模块、赋码服务器和数据库服务器[9]。从这些专利技术的研究来看，中药溯源体系正处于不断深入的研究中。 溯源体系通过采集记录产品的全过程信息，并将所采集到的信息记录到溯源团队所开发的溯源软件系统中，来强化质量安全管理，并进行风险的有效控制。中药溯源系统要求规范化的生产管理模式，标准的追溯信息以及用户能够通过网络及时查询中药材信息。其最终目的是让消费者安心放心，是整顿中药材市场混乱的有力手段，中药溯源体系能够实现对中药流通过程中中药所走路线和程序的监控，让中药材的流通透明化，在药材出现问题时，能够迅速地通过数据库，寻找到出现问题的环节，加以整改，或者追究责任。 1.3 中药溯源系统存在的问题 中药材溯源体系研究不超过二十年，如今，在进行试点的地区有四川、云南、湖南等多个省份，然而投入试验过程中，也发现了诸多问题。①同种中药材在不同的地区有着不同的名字，不同药材同名等现象，造成在记录时，系统中的不同用户有不同的录入行为；②中药种类众多，如今的溯源数据库不能做到完整记录；③溯源体系中的质量控制环节尤其重要，需要政府、企业以及消费者多方合作完成。 2 DNA条形码技术在溯源体系中的应用 中药溯源体系的关键在于质量控制技术，与传统的质量控制技术相比，溯源平台可用数据说话，在每一个环节后，设置标准的应当达到的数据指标（如：加工后的重量、颜色、形状等），然在此环节，单纯地采用称量以及根据此前的数据记录，难以准确的鉴定中药材的质量，因此，不得不利用到质量检测技术。 在此质量控制环节中使用DNA条形码技术，能够快速鉴别中药材的基原生物，据研究表明，DNA条形码技术能够准确地实现生物之间的种属鉴别，目前，该技术在法医[10]、生物分类等领域有着广泛的应用。 2.1 DNA条形码技术概念 DNA条形码是一段相对比较简短的基因序列，此序列有足够的变异、易扩增，能够标准的快速识别物种。基因序列鉴别物种方法首次被提出是2003年，由加拿大保罗.赫伯特（Paul Hebert）及其同事提出[11]。通过生物技术得到DNA序列后，将它与已有的物种的DNA序列进行对比，来确定物种。《中华人民共和国药典》正式收录DNA条形码技术做中药材的鉴定方法是2010年版，第三增補版[12]。进行了大量的研究后，将植物类药材的主序列定为内部转录间隔区2（ITS2），辅助序列为psbA-trnH，对于动物序列来说，以细胞色素c氧化酶亚基I（COI）为主序列，辅助序列则是ITS2[13]。 2.2 DNA条形码技术鉴定过程概述 使用DNA条形码技术鉴定中药材，需要经过7个步骤有：样品选定和采集、样品鉴定、DNA提取、PCR扩增、DNA测序及校序、中药材DNA条形码获得、结果判定。根据动植物药材的不同，采用不同的方法，而分别就动植物药材的不同药用部位，又有不同的技术标准，对于珍稀药材，特别是动物药材，在采集样本时，要格外注意不能给动物造成伤害。 进行DNA提取时，植物药材需要抑制细胞内的多糖多酚等物质的氧化反应和去除多糖，对于质地坚硬的，则需要根据需要增加水浴时间或降低水浴温度等；动物类药材，需要考虑是否进行脱脂操作等。PCR扩增时，植物类药材和动物类药材所使用的扩增序列不同，最终将得到的结果，查询标准的数据库（如图2），来验证药材的真伪。具体的操作指导，可参考《中华人民共和国药典》2015版中的《中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则》。 2.3 把关溯源关键环节 中药溯源把控质量需要注意的关键环节有三个：①药材在种植时，确保中药材的种子[14]正确；②在加工过程中，确保不会混入伪劣产品，确保加工方式方法正确；③最终输出成品，确保成品包装正确，记录的信息正确。 2.3.1 把关动植物药材质量 中药材中植物和动物药材的应用最广，也最多。保证动植物药材的种源正确，尤其重要。溯源的源头采用DNA条形码技术鉴别植物药材种源，已是一种成熟有效的技术。已运用到的药材有大青叶、贯众、板蓝根等[15]。特别是对于常见药材，例如甘草这类药材，常见的就有光果甘草、甘草、刺甘草、刺果甘草等[16]不同种类，在种植环节，很有可能由于疏忽，而使种下的药材从源头上就发生了错误，采栽之后经过加工，就更难区分出它的种类，而辅以DNA条形码技术，通过提取DNA并与标准的中药材DNA条形码鉴定系统甘草的标准DNA进行对比，则能够快速的辨认出药材的种类，保证药农种植的种子是药材真品无疑，如此，可做到溯源环节中确保药材来源的正确。 对于被称之为“血肉有情之品”[17]的动物药材，古籍中，记载的动物药材包含了鸟兽虫鱼，如在《灵枢.痈疽》中记录豕膏“杀虫，治皮肤风，涂恶疮”[18]。相比植物药材来说，动物药材更难采集，因此，一些商家为了盈利，掺杂混伪品的可能性也较植物药材高，而利用DNA的唯一性，是行之有效的监督检测方法。例如对于金钱白花蛇的鉴定，此蛇具有祛风、通络、止痉的功效[19]，然而它所存在的可能的混伪品有银环蛇、赤链蛇、铅色水蛇、赤链华游蛇、黄斑鱼游蛇、中华眼镜蛇、百花锦蛇、尖吻蝮等，所分布的区域覆盖中国从北到南，从西到东的众多省份（除内蒙古西部到新疆、西藏），而利用DNA条形码技术，在最适宜的季节（4-8月）捕捉，同时在不同的时间和地区采集其他蛇类，实施测序扩增后使用Chromas、Clustal X软件拼接，将所得序列与GenBank和BOLD中的记录进行对比，最终能够成功区分蛇的种类，确保所采集的金钱白花蛇的品质。 无论是植物药材还是动物药材，在加工后，分辨药材的真伪十分困难，此时使用溯源系统在此前阶段存储的数据，能够追踪到加工工序中，是否有差错，然却不能确保加工之中，是否加入了其他杂质药材，此处DNA条形码技术的使用，是验证确认的过程，保证药材加工后是真品，而溯源采集的重量、性状等数据，可以验证加工环节是否存在其他纰漏。 在最后销售过程，检验人员或消费者通过扫描溯源系统生成的二维码，就能知道药材的DNA及其他数据信息，让消费者放心用药。 检测环节就如同一个关卡，将整个溯源过程串联起来，贯穿溯源的质量控制全过程。从药材的生产到最终消费者使用，增加必要的中药质量检测，并将检测到的信息记录进入溯源系统。 2.3.2 把关溯源三个关键环节 总的来说DNA条形码主要应用在三个环节：①种子种源的检验，采用DNA条形码技术，能够在中药种子形状混乱的情况下，不考虑种子的来源，做DNA抽样检测[20]，辨出种子的真伪情况，并将信息录入到溯源体系的数据库中。②药材加工过程，在加工过程中，验证所加入的加工辅料是否正确，加工过程有没有参杂其他伪劣替代品种，加工完成后，在此环节做DNA条形码检测，能够确保中药材加工后的产品正确。③最终输出成品，这一个环节为溯源质量检测的末端，用以确保最终包装好，经过繁复的运输后，没有发生药材的变质耗损，在销售渠道上流通的是货真价实的药材，流通到消费者手中的中药材是有疗效的、高品质的，此处是消费者获取DNA条形码技术检测结果的过程，将信息传达给消费者，如此，DNA条形码技术高效的帮助溯源体系实现最终目的——让消费者安心放心。 2.4 贯穿溯源整个流程 中药溯源所涉及的产业链包括了中药农业、工業、商业以及服务行业，这些行业构成了整个中药材流通的过程，DNA条形码技术是将所得药材的DNA条形码信息经过检测后，精准的录入到溯源数据库中，上传至云端（如图3），将DNA信息融入中药材的其他信息中（如产地、性状、采收情况、加工方式、负责人等），如此，DNA的独一无二，保证了溯源码的独一无二。DNA条形码就如同中药材的标准防伪信息，在有条件进行DNA检测的企业或组织，可进行DNA检测后，通过溯源体系，追查到该药材的流通信息，而没有检测能力者可以通过扫码（如手机、智能终端等）追踪到药材信息，实现“扫一扫，知真伪”。 DNA条形码技术的应用涉及数据库的建立、中药材基原物种的鉴定、道地药材的鉴别以及中药溯源体系的研究[21]，已有实验表明，无论是种子，还是经过加工后的中药饮片等成品，在质量鉴定中，均能利用所得的DNA片段，与标准片段进行对比[22]，成功的区分出伪品、混伪品以及所携带的杂质。此处，我以苍术为例，简要的介绍在溯源体系中，如何利用DNA条形码技术，实现溯源全过程的追溯。 中国药典上记录，苍术的功效有治疗水肿、夜盲、湿焦中阻[23]等，是藿香正气水、国公酒等药材的重要组成成分。然，苍术的混伪品有朝鲜苍术、白术，野生苍术逐渐减少，许多种植户开始种植苍术。苍术的种植首先要解决的，便是正确的使用苍术种源[24]，此时，苍术幼苗没有形态，无法通过形态鉴别， DNA条形码技术的作用在于鉴别苍术的种苗是否正确，选出正确的种苗种植后，将种苗的DNA信息上传至溯源平台。在苍术采摘加工后，为防止加工过程中混入了混伪品，加工后用DNA条形码技术的采集成品的DNA信息，来鉴定成品的真伪，同样，将所得的信息上传至溯源平台，与种源的DNA信息相对比，可以得出是否是在溯源所记录的种植户处所购买的苍术。在销售环节，消费者通过唯一标识码，就可以得到含有苍术类药品经历的所有过程的信息。如果消费者在使用过程中出现问题，可以将所购买的产品带到能够进行DNA检测的机构，进行检测，将得到的DNA条形码信息与溯源数据库中的信息进行对比，得到该苍术产品流通过程中的信息，来查找问题环节。 3 总结与展望 DNA条形码技术作为中药材质量鉴定的新技术，通过与标准DNA数据库进行对比，能够做到迅速准确。鉴别所用的资料保存在数据库中，可作为溯源的永久保存材料。 溯源体系是一个记录和追踪的体系，检测把控好药材的质量关，才能保证整个溯源体系最终实现它的功能——让消费者用上放心中药。溯源体系能够给中药材的种植户、加工工厂、运输人员以及销售商加一把监管的锁，使其在需要对自己行为负责的条件下，更加重视操作的规范。 在中药质量检测的重要环节，运用DNA条形码技术，辅以其他鉴定手段，得到准确的鉴定结果，并记录鉴别信息到溯源的数据库中，本身也是在丰富DNA序列的数据库，结合已有的数据库，可为DNA条形码技术在溯源中的应用提供有利条件。 然新的技术也必然有新技术的局限性，中药材的种类众多，在溯源中的质量监控环节，依靠单一的DNA条形码技术，难以实现整体药材质量的把控。如今的科学研究，主要关注于植物和动物药材的DNA条形码的追踪溯源，而对于菌类的中药材，研究的较少，另外，矿物质药材不存在DNA，因此，无法使用此方法进行追踪溯源，然矿物药材同样存在掺假或劣质产品。对于动植物药材，DNA无法区分入药的具体部位[25]，也是一项必须要结合其他鉴别方法的原因。 参考文献： [1] 杨锐. 中药溯源工作方兴未艾[J]. 癌症康复， 2017（4）： 37-40. 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