氯硝柳胺和COS对紫贻贝的毒性作用机理

    邵跃

    

    

    

    摘?要：为研究氯硝柳胺和COS（一种树根中提取物）对紫贻贝抗氧化酶活性的影响，通过毒性试验的方法，测定紫贻贝组织的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、胆碱酯酶（CHE）的酶活性。结果表明，紫贻贝组织内SOD和MDA的变化趋势是上升-下降， CAT和CEA的变化趋势是下降-上升-下降的趋势，由此可见，在两种药物胁迫下，紫贻贝机体虽没有出现死亡表现，但其机体内的酶活性含量已发生了显著的变化，可见这两种药物可能主要通过干扰紫贻贝机体应激机制来间接地造成氧化性损伤，最终导致紫贻贝死亡。通过对比两种药物对紫贻贝的四种生物标志物第10天的抑制率可知，氯硝柳胺对紫贻贝酶活性的敏感顺序为：MDA>SOD>CHE>CAT，COS对紫贻贝酶活性的敏感顺序为：CHE>SOD>CAT>MDA，可见紫贻贝组织中MDA和SOD酶对氯硝柳胺反应敏感，CHE和SOD酶对COS反应敏感。

    关键词：海洋污损生物;紫贻贝;氯硝柳胺;COS （一种树根中提取物）;酶活性;毒性

    海洋污损生物是海洋中附着在船底、浮标等人工设施上的一类生物，给人类的生产和生活带来一定的危害。据统计，海洋污损生物约有2 000种，我国沿海约有200种，其中危害最大的有紫贻贝、牡蛎、藤壶等。为减少海洋污损生物给我们的生活和生产带来的危害，拟通过实验，研究出一种低毒高效的防污涂料。主要通过研究超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、胆碱酯酶（CHE）等生物标志物含量在受药物胁迫的紫贻贝组织中的变化，探索氯硝柳胺和COS（一种树根中提取物）对紫贻贝的毒性作用机理，从而为研究出一种低毒高效的新型防污涂料提供一个良好的依据。

    1?实验材料

    紫贻贝：来自海鲜市场，个体大小尽量均等，洗净暂养;实验室常规仪器。

    实验药品：氯硝柳胺（分析纯，母液浓度为0.200 g/L）、COS（分析纯，母液浓度为10.000 g/L）、考马斯亮蓝、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、胆碱酯酶（CHE）试剂盒、无水乙醇、冰乙酸等，以上药品均购自生物公司。

    海水经砂滤后抽取使用。温度为（20±1）℃，pH值为7.9～8.1，盐度为30‰。

    2?实验方法

    2.1?暴露试验

    将洗干净的紫贻贝放入装有20 L海水的养殖箱中，每个养殖箱放入20个大小均等的紫贻贝，

    分别投入8 mL的氯硝柳胺母液和100 mL的COS母液，曝气，在两种药物中暴露2、4、6、8、10 d 时取样，测定紫贻贝组织内SOD、CAT、CHE和MDA等酶活性含量。试验时期不投喂。

    2.2?组织匀浆的制备

    将经药物胁迫后的紫贻贝组织块在0.86%冷生理盐水中漂洗，再在滤纸上吸干水分，取0.2～1.0 g剪碎的组织块，并加入其重量9倍的冷生理盐水，在玻璃匀浆管中充分研磨十次（6～8 min），然后将制备好的组织匀浆用普通离心机3 000 r/min，离心10～15 min，制得10%组织匀浆，取上清液进行酶活性测定。

    2.3?酶活性测定

    组织酶蛋白、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、胆碱酯酶（CHE）的测定步骤按购自南京建成生物工程研究所的试剂盒的说明进行操作，所有指标的测定均设三个平行样。

    3?实验结果与分析

    3.1?氯硝柳胺和COS对紫贻贝组织内超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响

    在氯硝柳胺和COS胁迫下，2、4、6、8、10 d时紫贻贝组织内超氧化物歧化酶（SOD）活性变化见图1、图2。

    图1表明，紫贻贝在氯硝柳胺药物胁迫下，其组织内SOD活性随着药物胁迫时间的延长，表现出先升高后下降的变化规律，至第6天的时候到达最大值，与空白对照组（SOD含量为11.02 U/mgprot）相比，紫贻贝组织内的SOD活性下降了15.8%。随着药物胁迫时間的延长，SOD的活性迅速下降，胁迫第10天的时候，紫贻贝组织内的SOD活性与空白对照组相比，抑制率为71.4%。

    图2表明，紫贻贝在COS药物作用下，其组织内SOD活性随着COS作用时间的延长，表现出先升高后下降的变化规律，胁迫期间紫贻贝组织内SOD活性都低于对照组。药物在胁迫第6天的时候，SOD活性表现为一定的诱导作用，SOD活性升高，达到最大值，但与空白对照组相比，SOD活性下降了10.5%，随着药物胁迫时间的延长，SOD的活性呈下降趋势，COS胁迫第10天的时候，与空白对照组相比，其抑制率为69.1%。

    3.2?氯硝柳胺和COS对紫贻贝组织内过氧化氢酶（CAT）活性的影响

    在氯硝柳胺和COS胁迫下，2、4、6、8、10 d时紫贻贝组织内过氧化氢酶（CAT）活性变化见图3、图4。

    由图3可以看出，在氯硝柳胺胁迫的前6天，紫贻贝组织中CAT的酶活性逐渐降低，随着药物胁迫时间的继续延长，CAT活性迅速升高，直到胁迫第8天时，再次达到最高点，与胁迫第2天时CAT活性相比，其值是胁迫第2天时CAT活性的90%，但随着药物胁迫的继续延长，CAT活性迅速下降，达到最低值，为对照空白组（CAT含量为11.87 U/mgprot）相比，其抑制率为54.1%。

    由图4可以看出，在COS胁迫的前4天，紫贻贝组织中CAT的酶活性迅速降低，随着药物胁迫时间的继续延长，CAT活性迅速升高，在胁迫第6天时，再次达到最高点，与胁迫第2天时CAT活性相比，其值是胁迫第2天时CAT活性的75%，随着药物胁迫的继续延长，CAT活性迅速下降，与空白对照组相比，其抑制率为63.2%。

    3.3?氯硝柳胺和COS对紫贻贝组织内丙二醛（MDA）活性的影响

    在氯硝柳胺和COS胁迫下，2、4、6、8、10 d时紫贻贝组织内丙二醛（MDA）活性变化见图5、图6。

    MDA为膜脂过氧化产物，由图5可知，紫贻贝组织中MDA含量的变化与SOD含量变化趋势相对应，第6天达最高值，与空白对照组（MDA含量为10.38 nmol/mgprot）相比，其组织中MDA含量下降了53.4%。第6天后，MDA含量逐漸下降，胁迫第10天时，组织内的MDA含量，与对照组相比，其抑制率为78.4%，可能是此时膜已解体，细胞已趋死亡的原因。

    由图6可知，紫贻贝组织中MDA含量的变化与SOD含量变化趋势相对应，其含量一直都低于空白对照组，在胁迫第6天时达最高值，胁迫第6天后，MDA含量开始下降，胁迫第10天时，组织内的MDA含量与空白对照组相比，其抑制率为43.4%。

    3.4?氯硝柳胺和COS对紫贻贝组织内胆碱酯酶（CHE）活性的影响

    在氯硝柳胺和COS胁迫下，2、4、6、8、10 d时紫贻贝组织内胆碱酯酶（CHE）活性变化见图7、图8。

    由图7可知，在氯硝柳胺胁迫下，紫贻贝组织内CHE活性随着药物胁迫时间的延长，呈现出下降—上升—下降的趋势。在药物胁迫的前4天，CHE活性受到抑制，CHE活性迅速下降，之后随着胁迫时间的延长，CHE活性又迅速上升，在第6天时再次达到最大，但CHE活性为胁迫第2天的77.5%，在胁迫第6天之后，CHE活性又迅速下降，胁迫第10天的时候，紫贻贝组织内的CHE活性与空白对照组（CHE含量为7.83 U/mgprot）相比，其抑制率为69.9%。

    由图8可知，在COS胁迫下，紫贻贝组织内CHE活性随着药物胁迫时间的延长，呈现出下降—上升—下降的趋势。在药物胁迫前4天，CHE活性受到抑制，CHE活性迅速下降，之后随着胁迫时间的延长，CHE活性又迅速上升，在第6天时再次达到最大，但CHE活性为胁迫第2天的80.8%，在胁迫第6天之后，CHE活性又迅速下降，胁迫第10天的时候，紫贻贝组织内的CHE活性与空白对照相比，其抑制率为83.9%。

    4?讨论

    4.1?氯硝柳胺和COS对紫贻贝组织内SOD酶活性的影响

    本研究发现两种药物胁迫紫贻贝后，其组织内的SOD活性都呈现出先上升后下降的趋势，且两种药物胁迫下，SOD活性都低于对照空白组，由此表明在两种药物胁迫初期，机体出现一定的“毒物兴奋效应”，即药物在短时间内使紫贻贝组织内产生过量超氧阴离子自由基，为了使机体抗氧化防御系统免受损伤，紫贻贝组织内的SOD活性升高，而后随着药物胁迫时间的延长，紫贻贝体内产生大量的活性氧超过紫贻贝的SOD 清除能力时，便产生“毒物抑制效应”，对组织和细胞造成损伤，影响紫贻贝的正常生理活动，使SOD 活性降低和丧失[1]。与吕庆[2]的研究一致：当生物体受到轻度逆境胁迫时，SOD活性往往升高，而当受到重度逆境胁迫下，SOD活性通常降低，使生物体内积累过量的活性氧，从而导致生物体的伤害。因此，可以把机体中的SOD活性作为药物对该机体抗氧化防御系统影响的一个指标。

    4.2?氯硝柳胺和COS对紫贻贝组织内CAT酶活性的影响

    本实验发现两种药物胁迫紫贻贝后，其组织内的CAT活性呈现出下降—上升—下降的趋势，与吴益春[3]研究的在Cu2+胁迫下，栉孔扇贝肌肉和内脏组中CAT活性变化趋势相同。这是由于在药物胁迫初期，水体中药物在紫贻贝组织中蓄积及氧自由基的产生，同时机体体内SOD歧化反应，产生了大量的H2O2，破坏了紫贻贝机体的生理平衡，从而导致机体中CAT活性均有显著的抑制作用，随着药物胁迫时间的继续延长，机体的应激系统、抗氧化防御系统被全面激活，在H2O2的诱导下，CAT活性升高，以清除过量的氧自由基，使机体免受氧化伤害，从而表现为CAT酶活性迅速地升高。由于氧自由基反应速度非常快，随着药物胁迫时间的继续延长，有些未得到及时清除的氧自由基对细胞产生了不可逆的伤害，细胞结构受到一定程度的损伤，细胞的衰老加速，因此CAT酶活性又逐渐回落[3]，从而导致中毒反应发生，CAT酶活性再次下降，出现抑制作用。

    4.3?氯硝柳胺和COS对紫贻贝组织内MDA活性的影响

    本实验发现两种药物胁迫紫贻贝下，紫贻贝组织内MDA含量的变化与SOD含量变化趋势相对应，呈现出先上升后下降的趋势，这是由于药物胁迫初期，机体产生大量的过氧化自由基，诱发机体中MDA含量升高，随着药物胁迫时间的延长，紫贻贝体内产生大量的过氧化自由基超过紫贻贝机体的清除能力，对组织和细胞造成损伤，影响紫贻贝的正常生理活动，使MDA含量降低。

    4.4?氯硝柳胺和COS对紫贻贝组织内CHE酶活性的影响

    本实验发现两种药物胁迫紫贻贝后，其组织内的CHE活性呈现出下降—上升—下降的趋势，由此表明：在药物胁迫下，药物能够不可逆地与紫贻贝机体中的乙酰胆碱酯酶结合，从而抑制CHE的活性，导致机体内产生的乙酰胆碱不能及时分解，对机体的神经传导造成了一定的影响，之后随着药物胁迫时间的延长，为了保护机体的中枢神经系统，机体内的应激系统被激活，大量的乙酰胆碱脂酶迅速分解机体积累的乙酰胆碱，随后，乙酰胆碱脂酶活性受到抑制，紫贻贝体内积累大量的乙酰胆碱，从而使生物生理、生化过程失调和破坏，严重的甚至会导致生物死亡。在两种药物胁迫下，紫贻贝组织内的CHE活性变化范围相同，均低于对照空白组，且变化幅度相似，说明两种药物对紫贻贝机体内CHE活性的影响程度相同。从实验数值来看，两种药物对紫贻贝乙酰胆碱酯酶的抑制率较高，都达到60 %以上，因此，乙酰胆碱酯酶可被认为是较好的生物标志物。

    5?结论

    在低浓度的氯硝柳胺和COS胁迫下，紫贻贝组织中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）和胆碱酯酶（CHE）变化趋势相似，可知两种药物对紫贻贝的作用机理相似，同时随着氯硝柳胺和COS胁迫时间的延长，紫贻贝组织内SOD和MDA呈现出先上升后下降的趋势，CAT和CHE呈现出下降—上升—下降的趋势。由此可见：在两种药物胁迫下，紫贻贝机体虽没有出现死亡表现，但其机体内的酶活性含量已发生了显著的变化，可见这两种药物可能主要通过干扰紫贻贝机体应激机制来间接地造成氧化性损伤，最终导致紫贻贝死亡。通过对比两种药物对紫贻贝的四种生物标志物第10天的抑制率可知，氯硝柳胺对紫贻贝酶活性的敏感顺序为：MDA>SOD>CHE>CAT，COS对紫贻贝酶活性的敏感顺序为：CHE>SOD>CAT>MDA，可见紫贻贝组织中MDA和SOD酶对氯硝柳胺反应敏感，CHE和SOD酶对COS反应敏感。因此，可以通过研究海洋污损生物—紫贻贝机体内SOD、CAT、MDA、CHE活性的含量变化，来评价防污涂料对海洋生态及海洋生物的影响程度，为研制开发无毒、高效的防海生物污染材料提供理论依据。

    参考文献：

    [1] 江天久，曾淼，牛涛. 重金属Cd2+胁迫对近江牡蛎超氧化物歧化酶活性的影响[J].热带海洋学报，2006，25（6）：63-67.

    [2] 吕庆，郑荣梁.干旱及活性氧引起小麦膜脂过氧化及脱酯化[J].中国科学（C辑），1996，26（1）：26-30.

    [3] 吴益春，吕昕，王凡，等.Cu在扇贝组织中的蓄积及其对酶活性的影响[J].应用与环境生物学报，2005，11（5）：559-562.

    （收稿日期：2020-08-19）