包装饮用水中铜绿假单胞菌检验析释
刘小根+许春兰+金元宝
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种重要的水源性条件致病菌，广泛存在于各类型水中，对消毒剂、干燥、紫外线灯理化因素具有较强的抵抗力，可引起急性肠道炎、脑膜炎、败血症和皮肤炎症等疾病。近年来，铜绿假单胞菌污染桶装水的情况报道较多，是市面上包装饮用水最容易出现的质量问题；2016年江西省瓶（桶）装饮用水不合格率高发，主因是铜绿假单胞菌超标严重，该项目政府抽检不合格率为21.93%，远超其他抽检项目，质量安全问题十分严重，主要原因是生产企业没有做好日常生产过程的微生物监控，生产过程的消毒效果缺乏准确的验证方法，使得生产的产品质量失控。
GB8538-2016食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法是国家最新公布的针对包装饮用水铜绿假单胞菌的检验方法，检验程序如下：
标准的检测过程写的比较精炼，对于一般生产企业的检测人员来说在实际的检测过程中，会遇到比较多的问题，以下来对其中的可能的检测难点一一说明并推荐相应的解决办法。
操作步骤：
1.水样过滤。
取好的水样需在100级的洁净工作台用0.45um的滤膜进行抽滤，将微生物截留在滤膜上，再将滤膜贴在CN琼脂培养基上进行培养，应避免在滤膜和培养基之间夹留气泡。
这个步骤中有两个方面检测方法中未说明，一是采用何种滤器和如何灭菌，二是滤膜如何灭菌。
包装水生产企业可以购买专用的不锈钢滤器，一般材质是不锈钢的，可以用牛皮纸包好后直接放入灭菌锅内进行灭菌；也可以购买常见的砂芯过滤器（如津腾），同样可以用牛皮纸包好后放入灭菌锅灭菌；如果需要使用的滤器数量较多，介绍可以采用75%酒精全浸泡的方式灭菌，浸泡后放置在已灭菌容器中在洁净工作台晾干。使用前先用无菌水抽滤一次以避免酒精残留影响检测结果。浸泡半分钟以上即可起到灭菌效果。
通过使用添加了标准菌绿脓杆菌（ATCC27853）的生理盐水（高含量）和无菌生理盐水交叉过滤共6次，滤器灭菌方式分别采用灭菌锅高温灭菌和75%酒精全浸泡灭菌，CN琼脂培养后结果均符合要求：添加了标准菌的生理盐水样品在CN琼脂上生长良好，两种灭菌方式数量没有明细区别，特征符合；无菌生理盐水样品在CN琼脂上未发现有菌落生长（见图1）。
滤膜灭菌可以直接用纯水煮沸三次后使用，也可以放在合适的容器中加入适量无菌水，包好后放入高压灭菌锅121℃灭菌15分钟进行灭菌。
2.滤膜在CN琼脂培养和观察
CN琼脂培养后的菌落形态分以下三种，其它情况为非铜绿假单胞菌：
（1）蓝色或绿色的典型可疑菌落，直接做绿脓菌素的确证性实验，这个现象比较明显，也容易辨认；
（2）非蓝绿色而在365nm紫外灯照射下产荧光的菌落，这种类型的可疑菌落需进行乙酰胺肉汤确证性实验；
（3）是红褐色菌落紫外灯照射下也不产荧光，需进行氧化酶测试、乙酰胺液体培养基确证，金氏B培养基确证。
所有三种情况均需接种到营养琼脂培养基上进行纯化。
根据日常检测数据的统计，前两种的情况较多，第三种情况最少，而第二种即非蓝/绿色的产荧光的菌落最具有迷惑性，也是检验的难点所在，需要特别仔细的进行验证。
典型菌落的形态周围呈现融化的状态，菌落数较少的情况下，划线纯化比较简单；菌落数较多的情况划线就比较麻烦了，因为第一种典型可疑菌落是直接目测能看到的，而第二种情况产荧光是需要在360nm的紫外灯照射下才能看见是否产荧光，这就会可能导致划线纯化的时候可疑和典型菌落出现混淆错划的情况，会导致结果的截然不同。例如：挑取蓝绿色可疑菌落纯化时，因菌落溶解状扩大，可能挑取时不仅挑取到了蓝绿色可疑菌落，还挑取到其他类型可疑菌落，纯化后确证就可能导致结果完全改变的情况，解决办法是在这种菌落较多的情况下，可以采取计数后分开再在CN琼脂平板上划线一次，先在CN琼脂平板上分离中上述几种菌落的单个菌落，再划线接种到营养瓊脂平板上纯化后进行确证试验，已避免因挑取典型菌落出现差错导致结果的偏差。
3.确证性试验
这里需特别注意的是上述的第二种情况，即非蓝/绿色产荧光的可疑菌落的产氨实验：
纯培养物接种到乙酰胺液体培养基36℃培养20～24h后，滴加1～2滴钠氏试剂，检查产氨实验，有出现从深黄色到砖红色的颜色变化，则为阳性，否则为阴性。
在实际过程中会发现确证试验出现这种颜色变化过程的比例很高，是很多都是阳性结果吗？
经过使用生化试剂条鉴定发现有近六成的比例并不是铜绿假单胞菌，是什么原因呢，主要是时间的问题，时间比较久时，砖红色出现的几率比较高，会影响检测人员的判断，建议在3～5分钟内进行观察，并且一定要与阳性和阴性对照菌株进行比较观察，可有效降低误判。另外推荐一种简单的方法：如觉得还有疑问不能判定，可以从纯培养物接种划线到固体乙酰胺培养基进行培养，铜绿假单胞菌在固体培养基上的特征是灰白色，扁平，边缘不整齐，菌落周围培养基略带粉红色，可以结合固体和液体培养基的生长特征和现象进行判定，误判基本可以消除，此方法成本很低，一般的生产企业可以使用。
铜绿假单胞菌的污染主要来自三个方面，一是水源的污染，二是加工过程的污染，三是包装材料的污染，作为生产企业，需要通过提高自身的检测能力，分别监测这三个方面的污染情况，采取有效的消毒灭菌方式，并验证灭菌效果，可确保生产的产品质量安全有保障。
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种重要的水源性条件致病菌，广泛存在于各类型水中，对消毒剂、干燥、紫外线灯理化因素具有较强的抵抗力，可引起急性肠道炎、脑膜炎、败血症和皮肤炎症等疾病。近年来，铜绿假单胞菌污染桶装水的情况报道较多，是市面上包装饮用水最容易出现的质量问题；2016年江西省瓶（桶）装饮用水不合格率高发，主因是铜绿假单胞菌超标严重，该项目政府抽检不合格率为21.93%，远超其他抽检项目，质量安全问题十分严重，主要原因是生产企业没有做好日常生产过程的微生物监控，生产过程的消毒效果缺乏准确的验证方法，使得生产的产品质量失控。
GB8538-2016食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法是国家最新公布的针对包装饮用水铜绿假单胞菌的检验方法，检验程序如下：
标准的检测过程写的比较精炼，对于一般生产企业的检测人员来说在实际的检测过程中，会遇到比较多的问题，以下来对其中的可能的检测难点一一说明并推荐相应的解决办法。
操作步骤：
1.水样过滤。
取好的水样需在100级的洁净工作台用0.45um的滤膜进行抽滤，将微生物截留在滤膜上，再将滤膜贴在CN琼脂培养基上进行培养，应避免在滤膜和培养基之间夹留气泡。
这个步骤中有两个方面检测方法中未说明，一是采用何种滤器和如何灭菌，二是滤膜如何灭菌。
包装水生产企业可以购买专用的不锈钢滤器，一般材质是不锈钢的，可以用牛皮纸包好后直接放入灭菌锅内进行灭菌；也可以购买常见的砂芯过滤器（如津腾），同样可以用牛皮纸包好后放入灭菌锅灭菌；如果需要使用的滤器数量较多，介绍可以采用75%酒精全浸泡的方式灭菌，浸泡后放置在已灭菌容器中在洁净工作台晾干。使用前先用无菌水抽滤一次以避免酒精残留影响检测结果。浸泡半分钟以上即可起到灭菌效果。
通过使用添加了标准菌绿脓杆菌（ATCC27853）的生理盐水（高含量）和无菌生理盐水交叉过滤共6次，滤器灭菌方式分别采用灭菌锅高温灭菌和75%酒精全浸泡灭菌，CN琼脂培养后结果均符合要求：添加了标准菌的生理盐水样品在CN琼脂上生长良好，两种灭菌方式数量没有明细区别，特征符合；无菌生理盐水样品在CN琼脂上未发现有菌落生长（见图1）。
滤膜灭菌可以直接用纯水煮沸三次后使用，也可以放在合适的容器中加入适量无菌水，包好后放入高压灭菌锅121℃灭菌15分钟进行灭菌。
2.滤膜在CN琼脂培养和观察
CN琼脂培养后的菌落形态分以下三种，其它情况为非铜绿假单胞菌：
（1）蓝色或绿色的典型可疑菌落，直接做绿脓菌素的确证性实验，这个现象比较明显，也容易辨认；
（2）非蓝绿色而在365nm紫外灯照射下产荧光的菌落，这种类型的可疑菌落需进行乙酰胺肉汤确证性实验；
（3）是红褐色菌落紫外灯照射下也不产荧光，需进行氧化酶测试、乙酰胺液体培养基确证，金氏B培养基确证。
所有三种情况均需接种到营养琼脂培养基上进行纯化。
根据日常检测数据的统计，前两种的情况较多，第三种情况最少，而第二种即非蓝/绿色的产荧光的菌落最具有迷惑性，也是检验的难点所在，需要特别仔细的进行验证。
典型菌落的形态周围呈现融化的状态，菌落数较少的情况下，划线纯化比较简单；菌落数较多的情况划线就比较麻烦了，因为第一种典型可疑菌落是直接目测能看到的，而第二种情况产荧光是需要在360nm的紫外灯照射下才能看见是否产荧光，这就会可能导致划线纯化的时候可疑和典型菌落出现混淆错划的情况，会导致结果的截然不同。例如：挑取蓝绿色可疑菌落纯化时，因菌落溶解状扩大，可能挑取时不仅挑取到了蓝绿色可疑菌落，还挑取到其他类型可疑菌落，纯化后确证就可能导致结果完全改变的情况，解决办法是在这种菌落较多的情况下，可以采取计数后分开再在CN琼脂平板上划线一次，先在CN琼脂平板上分离中上述几种菌落的单个菌落，再划线接种到营养瓊脂平板上纯化后进行确证试验，已避免因挑取典型菌落出现差错导致结果的偏差。
3.确证性试验
这里需特别注意的是上述的第二种情况，即非蓝/绿色产荧光的可疑菌落的产氨实验：
纯培养物接种到乙酰胺液体培养基36℃培养20～24h后，滴加1～2滴钠氏试剂，检查产氨实验，有出现从深黄色到砖红色的颜色变化，则为阳性，否则为阴性。
在实际过程中会发现确证试验出现这种颜色变化过程的比例很高，是很多都是阳性结果吗？
经过使用生化试剂条鉴定发现有近六成的比例并不是铜绿假单胞菌，是什么原因呢，主要是时间的问题，时间比较久时，砖红色出现的几率比较高，会影响检测人员的判断，建议在3～5分钟内进行观察，并且一定要与阳性和阴性对照菌株进行比较观察，可有效降低误判。另外推荐一种简单的方法：如觉得还有疑问不能判定，可以从纯培养物接种划线到固体乙酰胺培养基进行培养，铜绿假单胞菌在固体培养基上的特征是灰白色，扁平，边缘不整齐，菌落周围培养基略带粉红色，可以结合固体和液体培养基的生长特征和现象进行判定，误判基本可以消除，此方法成本很低，一般的生产企业可以使用。
铜绿假单胞菌的污染主要来自三个方面，一是水源的污染，二是加工过程的污染，三是包装材料的污染，作为生产企业，需要通过提高自身的检测能力，分别监测这三个方面的污染情况，采取有效的消毒灭菌方式，并验证灭菌效果，可确保生产的产品质量安全有保障。
