猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的检测技术

    陈晓辉+薛梅+朱俊平

    摘要：猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是一种严重危害养猪业的传染病，常与其他病原混合感染，临床诊断非常困难，要确诊需要进行实验室检测。而及时诊断是防控PRRS的关键环节。从抗体的检测和病原的检测两个方面对PRRS的检测技术进行了简要综述，旨在为诊断PRRS提供指导。

    关键词：猪繁殖与呼吸综合征；抗体检测；病原检测

    中图分类号：S858.28 文献标识码： 文章编号：1007-273X（2016）12-0009-02

    猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome， PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus，PRRSV）引起的一种严重危害养猪业的传染病。以妊娠母猪流产、死产、弱胎、木乃伊胎等繁殖障碍及各年龄阶段猪的呼吸道症状为特征[1-3]。该病毒具有抗原变异性、嗜巨噬细胞性、持续感染性及抗体依赖增强性作用，临床上常与其他病原混合感染使临床表现形式复杂化[4-5]。要确诊需要进行实验室检测，实验室检测方法很多，每种方法在检测的特异性、敏感性、成本等方面存在差异。因此，建立有效且适合基层使用的PRRS检测方法是防控PRRS的重要环节，本文就PRRS检测方法进行了综述，供参考。

    1 抗体的检测

    免疫荧光抗体（IFA）试验、免疫过氧化酶单层细胞试验（IPMA）、血清中和（SVN）试验及酶联免疫吸附试验（ELISA）等都可用于检测PRRSV的特异性抗体，通过检测抗体水平可以对猪个体或整个猪群的PRRSV感染状况或疫苗免疫效果给予一定的评价。

    1.1 PRRSV抗体检出时间及维持时间

    当猪感染PRRSV 7～14 d后，机体首先产生IgG抗体，机体产生的抗体随着时间的积累呈增加的趋势，当抗体达到峰值后在体内维持一段時间，然后抗体水平逐渐下降，不同检测方法检测出的抗体出现峰值时间、峰值维持时间以及抗体在体内存留时间均不一致。在试验感染条件下，通过IgG-IFA、IPMA、ELISA、SVN方法可分别在感染后5～9、9～11、9～13、9～28 d内检测到抗体。PRRSV特异性IgM抗体在接种后5 d可以检测到，并可持续21～28 d。不同的方法检测出的抗体峰值时间各不相同：IFA 30～50 d、IPMA 35～50 d、ELISA 30～50 d、SVN 60～90 d，随后抗体滴度逐渐下降。感染PRRSV后用各种方法检测的抗体消失时间为： IFA 4～5个月、ELISA 4～10个月以上、IPMA 11～12个月、SVN12个月[6-8]。疫苗免疫后各种方法的检测结果与上述时间段基本一致。

    1.2 酶联免疫吸附试验（ELISA）

    ELISA适于大规模检测，方便、易行，操作过程及结果判断能够标准化，且具有高度的特异性和敏感性，以间接ELISA和阻断ELISA常见[6-8]。利用ELISA检测血清中PRRSV抗体出现的时间与用IPMA和IFA检测抗体出现时间基本相同，但是血清中PRRSV抗体持续时间明显长于IPMA和IFA所检测出的抗体维持时间，检出时间长达1年左右。

    ELISA诊断抗原有2种，一种是从细胞培养物中纯化的全病毒抗原，另一种是重组的PRRSV核衣壳蛋白。无论是用全病毒还是用基因表达产物作为诊断抗原建立的ELISA，均具有较强的背景反应。IDEXX公司生产的PRRSV抗体ELISA检测试剂盒在全球范围内推广使用，曾被认为是PRRSV抗体检测的金标准。但不久通过对照试验对该试剂盒检测效果进行评价，发现IDEXX试剂盒存在假阳性结果，PRRSV全病毒抗原间接ELISA与IDEXX HerdChek ELISA试剂盒相比，前者特异性仅为26.6%，敏感性也仅为48.8%。如果该方法应用于实际生产中，将会对PRRS的净化以及后备种猪的筛选带来严重后果。因此，在ELISA试剂盒研制上还需要广大从事ELISA试剂盒研制的人员做出更大的努力来弥补现有试剂盒的不足之处，进一步完善中国ELISA诊断试剂盒标准[8-10]。

    1.3 免疫过氧化酶单层细胞试验（IPMA）

    IPMA是广泛用于该病诊断的一种方法，其敏感性和特异性都较好，可用于PRRSV的血清抗体检测、病毒鉴定及抗原检测。自1991年建立至今，仍是欧洲和美洲国家广泛使用的血清学诊断方法。利用IPMA和商品化的PRRSV ELISA试剂盒检测抗体，并进行比较，发现利用同源性抗原检测抗体，IPMA比ELISA试剂盒检测出抗体的时间提前2～3 d，特别是对母源抗体的灵敏度更高，然而ELISA却能在不损失特异性的基础上提高敏感性，所以相比之下，ELISA更适合用来诊断PRRSV。由于IPMA结果判定具有一定主观性，不能自动显示，同时费时，检测费用高，不适合大规模检测，因此在实际生产中未得到广泛应用[9，10]。

    1.4 免疫荧光抗体（IFA）试验

    IFA法在美国被广泛利用，该法需进行细胞培养、荧光镜检，结果借助肉眼来观察，因实验室操作方法的不同、技术人员的不同和非特异性荧光等原因产生较大的主观性。对IFA和ELISA方法进行比较，结果发现二者具有很高的符合率，不符合的原因可能是血清抗体的水平太低。ELISA可以检测抗体滴度比较低的血清，而用IFA则检测不到，由此造成假阴性结果。

    利用间接荧光抗体试验对试验感染PRRSV的猪的抗体进行检测，结果表明，在感染病毒后9～14 d，首先检测出IgG抗体，高滴度的IgG抗体可以维持7周；感染病毒后35 d再次接种PRRSV，体内IgG抗体滴度不发生变化，病毒血症仍可检测到。在接种5～28 d可以检测到IgM抗体，35 d后再次接种病毒其抗体在短时间内增加。利用荧光抗体试验在不同时间对IgM抗体水平进行检测，在短时间内有助于鉴别是否感染PRRSV。因此，在实际生产过程中要尽可能避免假阴性结果的出现，在条件允许情况下结合其他检测结果得出结论[9-11]。

    血清中和试验与IFA和ELISA相比，其敏感性低，原因可能是由于PRRSV特异的中和抗体出现比较晚，要在感染后30～60 d才能检测到。对于急性感染的敏感性更差，与其他检测方法的结果符合率低，达不到早期诊断的目的。因此，该方法不适合应用于实际生产中，仅限于实验室诊断[10-12]。

    血清学呈阳性的结果并不能确定PRRSV是否能引起临床发病，也不能区别是感染野毒还是疫苗毒，也不能说明动物机体是否为病毒的携带者，仅能说明曾经感染过PRRSV。对于血清学阴性可能是未感染PRRSV或感染但还未产生抗体，或以前感染过但现在血清转阴，或是检测方法的敏感性不够或操作误差。因此，现有的血清学方法不适合监测整个猪群的群体情况，其仅能对单个个体作出初步诊断，要作出更准确的诊断，还应与免疫状况或病毒分离或抗原的检测相结合，才能达到对PRRS诊断、疫情净化的目的[10-12]。

    2 病原的检测

    病原的检测主要包括免疫学检测以及生物学检测，其中免疫学检测包括免疫荧光染色法、免疫过氧化物酶染色法以及免疫胶体金技术等，而生物学检测主要进行病毒的分离；核酸的检测主要利用分子生物学技术对病毒特定的基因组进行检测。由于免疫学检测存在较大的弊端，下面仅对生物学检测以及核酸检测技术作一简单的概述。

    2.1 生物学检测—病毒的分离

    用于PRRSV分离的细胞有原代猪肺巨噬细胞（PAM）、传代细胞系CL2621和Marc145。其中PAM最常用，因为传代细胞系对该病毒易感性差，故不能完全代替PAM，而且由于不是每批巨噬细胞对病毒的易感性都相同，所以在用PAM进行分离病毒前，还要进行批次试验，只有当特定滴度的标准病毒在新的巨噬细胞中生长良好时，方可使用，该方法是诊断PRRSV感染的经典方法，多用于急性病例的确诊和新疫区的确定，但是也存在不足之处，如费用较高、劳动强度较大，耗时多，且有可能污染其他病毒等，因此该方法不利于大规模猪场疫病的检测[10-12]。

    2.2 核酸检测（反转录-聚合酶链式反应）

    核酸检测（反转录-聚合酶链式反应）反转录-聚合酶链式反应（Reverse transcription polymer-ase chain reaction， RT-PCR）廣泛应用于PRRSV的鉴定及临床诊断，并在方法上不断改进和提高，扩增的目的片段也主要是针对PRRSV的核衣壳蛋白基因，主要的原因是PRRSV基因组中ORF7编码的核衣壳蛋白（N蛋白）中包括所有毒株都保守的共同表位和区别于欧洲型的特异性决定簇。RT-PCR比病毒分离更省时、省力，敏感性和特异性更强。用于RT-PCR检测的样品包括血清、精液及肺脏、脾脏等组织[13-15]。

    利用RT-PCR对试验感染猪进行抗原和抗体检测，并与病毒分离和ELISA抗体检测结果进行了比较，结果发现该方法可以在感染24 h后检测到病毒的核酸，但不能分离到病毒，而抗体只能在感染后第9d检测到，由此可见RT-PCR的灵敏度明显高于病毒分离和ELISA，有利于早期诊断[13-15]。

    PCR方法可以区分欧洲株与美洲株，但其临床应用意义并不大。国外应用PCR诊断PRRSV已取得很大进展，许多学者根据PRRSV不同的ORF序列，设计了不同引物，建立了检测PRRSV核酸的RT-PCR方法。随着RT-PCR技术的发展，也陆续出现了荧光标记的RT-PCR方法，如采用TaqManTMRT-PCR或分子信标RT-PCR方法检测临床样品，这些方法比常规RT-PCR方法的特异性更强，敏感性更高，但需要更高的成本。应特别注意的是，因其敏感性特别高，易引起假阳性，因此在检测时应尽可能避免RNA的污染。RT-PCR方法在PRRS的诊断及监测中发挥很大作用，在ELISA检测为阳性的基础上，再用高敏感性的RT-PCR进行确诊，这不仅可以降低费用，而且可拓宽RT-PCR的应用前景，如后备种猪的筛选，持续性感染猪的诊断及猪群的净化等[13-15]。

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