藏猪促红细胞生成素的表达与低氧适应的研究

    潘瑶+陈和强

    摘要：为了分析藏猪促红细胞生成素（EPO）的表达与低氧适应的关系，对高海拔藏猪（ZZ）和大约克夏猪（YZ），低海拔藏猪（ZB）和大约克夏猪（YH）的肾脏组织EPO蛋白的表达量进行了检测分析。结果表明，当大约克夏猪处在高海拔应急状态下时，EPO的表达量高于藏猪；长期生活在高原的大约克夏猪EPO 的表达量较藏猪低，但高于低海拔大约克夏猪。说明藏猪适应高原低氧环境的主要因素为EPO的稳定表达，高原大约克夏猪肾脏组织内EPO的高表达，是其对高原低氧环境适应的生理调节过程。

    关键词：藏猪；促红细胞生成素（EPO）；低氧适应

    中图分类号：S828 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2016）06-0008-02

    藏猪生活的地域主要为青藏高原2 500～4 300 m海拔的半农半林半牧区以及农区，属于独特的高原型地方猪种，高原低氧适应能力非常强[1]。本研究主要分析了藏猪促红细胞生成素（EPO）的表达与低氧适应的关系。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 试验对象 本试验所用高海拔藏猪（ZZ）和高海拔大约克夏猪（YZ），均来自西藏，低海拔藏猪（ZB）和低海拔大约克夏猪（YH），分别来自北京和安徽，均选择6头，6个月大，无任何疾病，体重没有明显差别，相互之间没有亲缘关系。选取试验猪的肾脏组织，利用液氮对其迅速进行冷冻，保存于-80 ℃温度下，以备蛋白提取。

    1.1.2 仪器与试剂 水平脱色摇床、凝胶电泳及转膜系统、UV2000紫外可见分光光度计、高通量组织研磨仪、高速冷冻离心机等。

    无水乙醇、一抗及二抗稀释液、过硫酸铵、二硫苏糖醇、DBA辣根过氧化物酶显色试剂盒、预染彩虹蛋白Marker、硫脲、丙烯酰胺储液、尿素、蛋白酶抑制剂—苯甲基磺酰氟PMSF、磷酸、封闭液等。

    1.2 方法

    1.2.1 蛋白提取 在圆底EP管中放入微量液氮冻结组织，将含有蛋白酶抑制剂的尿素裂解液选取适量加入其中，利用匀浆器进行匀浆处理，15 500 r/min离心50 min，选取上清液作为总蛋白。定量蛋白选择Bradrord检测法完成。

    1.2.2 电泳 依照固定配方进行不连续PAGE制备，1板8.3 cm（W）×7.3 cm（L）。在3～15 μL上样缓冲液中加入等量样品，在PCR仪上进行6 min的变形处理，温度为99 ℃，马上放到冰浴中进行冷却。在12 mA的电流下进行1.5～2.0 h的稳流电泳。

    1.2.3 Western blotting 先选择甲醇将0.45 μm孔径的PVDF膜激活，接着在转移缓冲液中将凝胶、滤纸以及PVDF膜浸透，根据说明组装海绵垫→滤纸→凝胶→PVDF膜→滤纸→海绵垫，在电流为300 mA的恒流下进行1.5 h的转移。选择TBS对转后的PVDF膜进行30 s的漂洗，在4 ℃的封闭液中过夜。按1∶250以及1∶1 000利用一抗稀释液对目的蛋白EPO以及内参蛋白tubulin抗体进行稀释，在室温下进行2 h的孵育。进行3次PBST洗膜，均为5 min，将没有结合的一抗洗去。用二抗稀释液对二抗进行稀释，在室温下将膜放置其中进行1.5 h的孵育，进行5次PBST洗膜，每次均为5 min，将没有结合的二抗洗去[2]。应用DAB法进行显色处理，在蒸馏水中使显色终止，晾干显影后的PVDF利用扫描仪进行扫描，备电子版使用。

    1.3 统计方法

    选择SPSS19.0对研究统计数据进行分析，P<0.05为差异有统计学意义。

    2 结果与分析

    2.1 电泳结果

    结果显示在20～170 ku存在非常丰富的蛋白，整个电泳期间蛋白保存完好，条带清晰。

    2.2 EPO蛋白在两种猪肾脏组织的表达

    检测结果表明，EPO表达量显示了海拔高低及个体间的差异。进一步分析代表性的3组结果，A组中ZZ、ZB、YZ、YH的EPO表达量分别为（0.083±0.008）、（0.072±0.006）、（0.111±0.011）、（0.047±0.007），ZZ与ZB、YZ、YH间均差异明显（P<0.05），EPO表达量排序为YZ>ZZ>ZB>YH；B组EPO表达量，ZZ与ZB间无明显差异（P>0.05），ZZ与YZ、YH间差异明显（P<0.05），EPO表达量排序为ZZ>ZB>YZ>YH；C组EPO表达量，ZZ与YZ间，YZ与ZB、YH间差异明显（P<0.05），大小顺序为ZB>ZZ>YZ>YH。

    3 讨论

    研究发现海拔不同的藏猪和大约克夏猪肾脏组织EPO蛋白存在差异，对EPO与低氧适应的关系进行了简单探讨。试验结果表明，长期的低氧环境使得藏猪EPO实现稳定表达，当大约克夏猪处在高海拔应急状态下时，EPO的表达量高于藏猪；长期生活在高原的大约克夏猪EPO 的表达量较藏猪低，但高于低海拔大约克夏猪。说明藏猪适应高原低氧环境的主要因素为EPO的稳定表达，高原大约克夏猪肾脏组织内EPO的高表达，是其对高原低氧环境适应的生理调节过程。藏猪是高原型独有的猪种，是研究低氧适应机制的有力代表，并且能够延伸至整个哺乳动物界在高原低氧环境中的适应性机制。

    参考文献：

    [1] 孔小艳，苟 潇，马 腾，等.藏猪低氧适应的血液生理指标研究[J].云南农业大学学报，2014，29（2）：297-300.

    [2] 徐业芬，王 震，牛家强，等.西藏林芝地区藏猪心电图分析[J].安徽农业科学，2016（4）：143-146.