渔用荚膜红假单胞菌商品保存技术

    李大列+黎建斌

    

    

    

    摘 要：为优化渔用荚膜红假单胞菌（Rhodopseudomona capsulata）商品保存技术，首先对实验室选育保存的高效荚膜红假单胞菌（菌种NC01）进行菌种扩大培养，再采用正交试验方法，研究不同的保存温度、菌液pH值、包装桶规格、透光度、颜色对渔用荚膜红假单胞菌商品保存期的影响，并采用单因素试验方法，研究在菌液中添加保护剂后的保存效果。结果显示，在商品菌液中添加 0.5 g/L维生素C，调节菌液pH值7.0，采用5 L透光度2 500 lx的绿色塑料桶包装，在温度25 ℃下保存效果最好。应用最适宜保存技术保存渔用荚膜红假单胞菌商品两个月，菌液的有效活菌数≥2.76×109个/mL，比普通保存技术提高了67.27%，两者差异显著（P<0.05），为渔用荚膜红假单胞菌商品的保存提供了一种全新、有效的保存技术。

    关键词：渔用荚膜红假单胞菌（Rhodopseudomona capsulata）；商品；保存

    光合细菌是在水产养殖上广泛应用的微生物菌种之一。它不仅能净化水质，而且含有丰富的营养，可作为鱼虾的饲料添加剂，同时能促进养殖品种的繁殖，提高鱼苗、虾等的成活率。由于渔用光合细菌不耐高温，因此，采用成本低的工艺路线研制粉状制剂较为困难。目前市场上销售的渔用光合细菌多为液态产品，而液体产品都存在菌种保质期较短，菌种在保存中渐渐死亡的问题，这严重影响了渔用光合细菌商品的保存期与应用效果。张李阳等（2005）对几种光合细菌保种方法进行了比较，发现冷冻干燥法保存光合细菌最好，但成本较高。从综合考虑，固体、半固体法最适合不同条件的实验室进行光合细菌菌种保存[1]。张芳蕾等（2009）用正交实验方法探讨菌剂保藏的光线、温度及pH对液态浓缩制剂保藏期的影响，以及在菌剂中添加化学物质后的保藏效果。正交试验结果表明，光合细菌浓缩菌剂在pH值5.5、室温及避光条件下保藏效果最好。而在菌剂中添加1%甘油、7%二甲亚砜和0.5～1.1 μg/mL红霉素对延长菌剂的保藏均较为有效，其中以添加1%甘油的保藏效果更好[2]。王家芳等（2011）以硫酸铝钾作絮凝剂，海藻糖作保护剂，陶瓷粉作固定剂，分别在常温，4～20 ℃下保存光合细菌G3菌株，30 d后测定有效活菌数并观察生长情况。结果表明：固定化保存的光合细菌活性较好，生长繁殖旺盛[3]。目前我国渔用光合细菌商品保质期较短，菌种在保存过程中细胞死亡率高、容易造成变异和污染。但目前尚无延长渔用光合细菌商品保存期的研究报道。对实验室选育保存的高效荚膜红假单胞菌（Rhodopseudomona capsulata，菌种NC01）进行菌种扩大培养，采用正交和单因素试验方法对渔用荚膜红假单胞菌商品进行保存试验，研发出一种全新、有效的保存技术，显著提高产品的保存期限和细胞活性，为渔用荚膜红假单胞菌商品在水产养殖上的广泛应用提供有效的保障。

    1 材料与方法

    1.1 试验材料

    1.1.1 试验菌种

    试验菌株PSB由广西水产科学研究院南宁海可海乐微生物工程有限公司从高产虾塘底泥中分离保存，经鉴定为红螺菌科荚膜红假单胞菌（菌株编号NC01）。

    1.1.2 培养基

    液体配方[4]：使用本课题组优化筛选的最佳培养基，其基本成分如下： CH3COONa 3.0 g，NH4Cl 0.8 g， KH2PO4 1.0 g，MgSO4·7H2O 050 g，酵母膏1.5 g，CaCl2 50 mg，MnSO4 25 mg，FeSO4 5.00 mg，调节pH值至 7.0，曝气自来水 1 000 mL。

    1.2 试验方法

    1.2.1 菌种扩大培养

    用5 L无色透明聚乙烯塑料桶培养，将活化后的菌种以30%接种于已灭菌的优化培养基中，置于室外自然光源下，温度控制在30 ℃左右、光照度为6 000～8 000 lx，静置培养5 d后待细胞培养液呈现深红色，取样测定有效活菌数≥3.18×109个/mL、pH值8.5～8.8备用。

    1.2.2 保存条件正交试验

    将扩培后的菌液摇匀分装到聚乙烯塑料桶中，采用L16（45）正交试验方法，每个试验方案做2个重复，共32桶，保存两个月，取样测定菌液的有效活菌数，取其平均值。研究不同的温度、菌液pH值、包装桶规格、透光度、颜色对渔用荚膜红假单胞菌商品保存期的影响。试验以测定保存两个月的商品菌液有效活菌数为指标进行评价，优化出最适宜的保存条件。正交试验方案见表1。

    1.2.3 保護剂单因素试验保存试验

    在菌液中添加0.0%（空白对照组）、0.5%、1.0%、1.5%和2%的甘油，每个梯度设2个重复，共10桶，在最适宜的保存条件下保存两个月，每隔15 d取样测定菌液的有效活菌数，取其平均值，研究不同浓度的甘油对渔用荚膜红假单胞菌商品保存效果的影响，优化出最适宜的添加量。

    在菌液中添加0.0 g/L（空白对照组）、0.25 g/L、0.5 g/L和1.0 g/L的维生素C，每个梯度设2个重复，共8桶，在最适宜的保存条件下保存两个月，每隔15 d取样测定菌液的有效活菌数，取其平均值，研究不同浓度的维生素C对渔用荚膜红假单胞菌商品保存效果的影响，优化出最适宜的添加量。

    1.2.4 不同保存技术的综合对比试验

    将扩培好的菌液在最适宜和普通保存条件下保存渔用荚膜红假单胞菌商品两个月，每个梯度设2个重复，共4桶，每隔15 d取样测定菌液的有效活菌数，取其平均值，并进行转接复苏，观察菌的生长情况。

    1.3 测定指标及方法

    用ZDS-10型照度计测定透光度；用PHS-3C型pH计测定pH值；用光合细菌基础培养基[5]以平板菌落计数法测定细胞有效活菌数。

    1.4 数据处理