基于ELF—97的新型H2O2荧光探针的合成与性能研究
蔡子君+匡永清+潘丹 刘伟 蒋健晖
摘 要 以5-氯水杨醛，4-溴甲基苯硼酸，2-氨基-5-氯苯甲酰胺为原料合成了一种基于ELF-97的新型H2O2荧光探针P1，并用1H NMR，13C NMR和HRMS对其结构进行了表征。此探针在0.02 mol/L PBS-DMSO （9∶1， V/V， pH=7.4） 的溶液中，在360 nm激发光激发下，最大发射波长为425 nm， 荧光微弱；加入H2O2后，相同的激发波长下，425 nm发射峰消失，同时在515 nm处出现强的荧光发射峰。515 nm处荧光强度与H2O2的浓度呈动态学相关性，线性响应范围为5～45 μmol/L，检出限为0.1 μmol/L，牛奶中检测H2O2的回收率在94.0%～106.0%之间。探针P1对H2O2的快速检测具有潜在的应用价值。
关键词 荧光探针； ELF-97； 过氧化氢
1 引 言
过氧化氢（H2O2）是生物体内最主要的活性氧物种之一，可参与体内的氧化损伤[1，2]、免疫应答[3～6]、血管重塑[7，8]以及恶性肿瘤的发生发展等病理生理过程[9]。此外，一些食品生产企业将H2O2作为廉价的氧化剂、漂白剂，超量或非法使用，导致食品中H2O2残留超标，有时甚至会引起食物中毒[10]。因此，实时、灵敏、高选择性地检测H2O2的含量，对于疾病诊断、病理研究以及食品安全监测等具有十分重要的意义。文献报道的H2O2检测方法有高效液相色谱法[11]、化学发光法[12]、电化学法[13，14]及荧光法[15～19]等，其中荧光法具有灵敏度高、操作方便、成本低等优点，因而应用最为广泛。现有H2O2荧光探针大多是以芳基硼酸（酯）作为H2O2识别基团，当芳基硼酸（酯）被H2O2氧化
后可直接或间接活化荧光团[20]。2-（2′-羟基-5′-氯）苯基-6-氯-4-（ ）-喹唑啉酮（ELF-97，图1）是一种新型荧光染料，具有水溶性低、固相发光效率高、斯托克斯位移大等特性。用识别基团对其2′位酚羟基进行修饰，制备有机探针，可有效消除其长波长的荧光； 当探针与待测物质反应后，修饰基团离去，长波长荧光增强，藉此可达到检测目的。利用此特性已经成功构建了检测单胺氧化酶[21]、β-内酰胺酶[22]、碱性磷酸酶[23]及β-葡萄糖醛酸苷酶[24]的荧光探针。本研究采用4-溴甲基苯硼酸对ELF-97的羟基进行共价修饰，
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
F7000荧光分光光度计（日本HITACHI公司）； LTQ Orbitrap Velos Pro型质谱仪（瑞士Thermo-Fisher Scientific公司）； INOVA-400（美国Varian公司）； HSGF254薄层层析硅胶板（烟台江友硅胶开发有限公司）。
5-氯水杨醛和2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌（Acros试剂）； 4-溴甲基苯硼酸（ABCR试剂）； 2-氨基-5-氯苯甲酰胺（TCI试剂）； 其它试剂均为国产分析纯。
2.2 探针P1的合成
2.2.1 化合物2的合成 5-氯水杨醛（200 mg， 1.28 mmol）溶于5 mL丙酮中，加入K2CO3（270 mg， 1.92 mmol），室温下搅拌15 min后，加入4-溴甲基苯硼酸（275 mg， 1.28 mmol）和KI （106 mg， 0.64 mmol），回流6 h。反应完毕，过滤除去K2CO3，滤液减压浓缩，粗产物经柱层析分离（V石油醚∶V乙酸乙酯=5∶1），得化合物2白色固体156 mg。产率42.0%。 1H NMR （400 MHz，d6-DMSO） δ （ppm）： 10.36（s， 1H）， 8.09（s， 2H）， 7.83（d， J=8.0 Hz， 2H）， 7.70 （dd， J1=8.8 Hz， J2= 2.8 Hz， 1H）， 7.65 （d， J=2.0 Hz， 1H）， 7.47 （d， J=8.0 Hz， 2H）， 7.36 （d， J=8.8 Hz， 1H），5.32 （s， 2H）； 13C NMR （100 MHz， d6-DMSO） δ （ppm）： 188.67， 159.70， 138.32， 136.04， 134.83， 127.49， 126.97， 126.14， 125.68， 117.00， 79.68， 70.82，HRMS （ESI） m/z： 289.0444（理论值）， 289.0419（测量值） [M-H]
2.2.2 探针P1的合成
探针P1的合成路线如图2所示。化合物2 （90 mg， 0.31 mmol）， 2-氨基-5-氯苯甲酰胺（53 mg， 0.31 mmol）， TsOH·H2O（6 mg， 0.03 mmol）溶于10 mL无水乙醇中，加热回流1 h。将反应液冷却至0 ℃，加入2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌（70 mg， 0.31 mmol），在冰浴条件下搅拌1 h，有白色固体生成。反应完毕，抽滤收集白色固体，用少量冷却乙醇淋洗3次，得探针P1白色固体60 mg。产率43.9%。1H NMR （400 MHz，d6-DMSO） δ （ppm）： 12.52 （s， 1H）， 8.10～8.04（m， ）， 7.88（dd， J1=9.2 Hz， J2=2.8 Hz， 1H）， 7.77～7.72（m， ）， 7.61（dd， J1=8.8 Hz， J2=2.8 Hz， 1H）， 7.41（d， J= 8.0 Hz， 2H）， 7.31（d， J= 9.2 Hz， 1H）， 5.22（s， 2H），13C NMR （100 MHz， d6-DMSO） δ （ppm）： 160.65， 155.66， 152.00， 148.04， 138.58， 135.13， 134.66， 132.19， 131.61， 130.33， 130.21， 126.63， 125.33， 125.04， 124.94， 122.80， 115.64， 70.74，HRMS （ESI）m/z： calcd 441.0575，found 441.0603 [M+H]+。
摘 要 以5-氯水杨醛，4-溴甲基苯硼酸，2-氨基-5-氯苯甲酰胺为原料合成了一种基于ELF-97的新型H2O2荧光探针P1，并用1H NMR，13C NMR和HRMS对其结构进行了表征。此探针在0.02 mol/L PBS-DMSO （9∶1， V/V， pH=7.4） 的溶液中，在360 nm激发光激发下，最大发射波长为425 nm， 荧光微弱；加入H2O2后，相同的激发波长下，425 nm发射峰消失，同时在515 nm处出现强的荧光发射峰。515 nm处荧光强度与H2O2的浓度呈动态学相关性，线性响应范围为5～45 μmol/L，检出限为0.1 μmol/L，牛奶中检测H2O2的回收率在94.0%～106.0%之间。探针P1对H2O2的快速检测具有潜在的应用价值。
关键词 荧光探针； ELF-97； 过氧化氢
1 引 言
过氧化氢（H2O2）是生物体内最主要的活性氧物种之一，可参与体内的氧化损伤[1，2]、免疫应答[3～6]、血管重塑[7，8]以及恶性肿瘤的发生发展等病理生理过程[9]。此外，一些食品生产企业将H2O2作为廉价的氧化剂、漂白剂，超量或非法使用，导致食品中H2O2残留超标，有时甚至会引起食物中毒[10]。因此，实时、灵敏、高选择性地检测H2O2的含量，对于疾病诊断、病理研究以及食品安全监测等具有十分重要的意义。文献报道的H2O2检测方法有高效液相色谱法[11]、化学发光法[12]、电化学法[13，14]及荧光法[15～19]等，其中荧光法具有灵敏度高、操作方便、成本低等优点，因而应用最为广泛。现有H2O2荧光探针大多是以芳基硼酸（酯）作为H2O2识别基团，当芳基硼酸（酯）被H2O2氧化
后可直接或间接活化荧光团[20]。2-（2′-羟基-5′-氯）苯基-6-氯-4-（ ）-喹唑啉酮（ELF-97，图1）是一种新型荧光染料，具有水溶性低、固相发光效率高、斯托克斯位移大等特性。用识别基团对其2′位酚羟基进行修饰，制备有机探针，可有效消除其长波长的荧光； 当探针与待测物质反应后，修饰基团离去，长波长荧光增强，藉此可达到检测目的。利用此特性已经成功构建了检测单胺氧化酶[21]、β-内酰胺酶[22]、碱性磷酸酶[23]及β-葡萄糖醛酸苷酶[24]的荧光探针。本研究采用4-溴甲基苯硼酸对ELF-97的羟基进行共价修饰，
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
F7000荧光分光光度计（日本HITACHI公司）； LTQ Orbitrap Velos Pro型质谱仪（瑞士Thermo-Fisher Scientific公司）； INOVA-400（美国Varian公司）； HSGF254薄层层析硅胶板（烟台江友硅胶开发有限公司）。
5-氯水杨醛和2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌（Acros试剂）； 4-溴甲基苯硼酸（ABCR试剂）； 2-氨基-5-氯苯甲酰胺（TCI试剂）； 其它试剂均为国产分析纯。
2.2 探针P1的合成
2.2.1 化合物2的合成 5-氯水杨醛（200 mg， 1.28 mmol）溶于5 mL丙酮中，加入K2CO3（270 mg， 1.92 mmol），室温下搅拌15 min后，加入4-溴甲基苯硼酸（275 mg， 1.28 mmol）和KI （106 mg， 0.64 mmol），回流6 h。反应完毕，过滤除去K2CO3，滤液减压浓缩，粗产物经柱层析分离（V石油醚∶V乙酸乙酯=5∶1），得化合物2白色固体156 mg。产率42.0%。 1H NMR （400 MHz，d6-DMSO） δ （ppm）： 10.36（s， 1H）， 8.09（s， 2H）， 7.83（d， J=8.0 Hz， 2H）， 7.70 （dd， J1=8.8 Hz， J2= 2.8 Hz， 1H）， 7.65 （d， J=2.0 Hz， 1H）， 7.47 （d， J=8.0 Hz， 2H）， 7.36 （d， J=8.8 Hz， 1H），5.32 （s， 2H）； 13C NMR （100 MHz， d6-DMSO） δ （ppm）： 188.67， 159.70， 138.32， 136.04， 134.83， 127.49， 126.97， 126.14， 125.68， 117.00， 79.68， 70.82，HRMS （ESI） m/z： 289.0444（理论值）， 289.0419（测量值） [M-H]
2.2.2 探针P1的合成
探针P1的合成路线如图2所示。化合物2 （90 mg， 0.31 mmol）， 2-氨基-5-氯苯甲酰胺（53 mg， 0.31 mmol）， TsOH·H2O（6 mg， 0.03 mmol）溶于10 mL无水乙醇中，加热回流1 h。将反应液冷却至0 ℃，加入2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌（70 mg， 0.31 mmol），在冰浴条件下搅拌1 h，有白色固体生成。反应完毕，抽滤收集白色固体，用少量冷却乙醇淋洗3次，得探针P1白色固体60 mg。产率43.9%。1H NMR （400 MHz，d6-DMSO） δ （ppm）： 12.52 （s， 1H）， 8.10～8.04（m， ）， 7.88（dd， J1=9.2 Hz， J2=2.8 Hz， 1H）， 7.77～7.72（m， ）， 7.61（dd， J1=8.8 Hz， J2=2.8 Hz， 1H）， 7.41（d， J= 8.0 Hz， 2H）， 7.31（d， J= 9.2 Hz， 1H）， 5.22（s， 2H），13C NMR （100 MHz， d6-DMSO） δ （ppm）： 160.65， 155.66， 152.00， 148.04， 138.58， 135.13， 134.66， 132.19， 131.61， 130.33， 130.21， 126.63， 125.33， 125.04， 124.94， 122.80， 115.64， 70.74，HRMS （ESI）m/z： calcd 441.0575，found 441.0603 [M+H]+。
