益气化瘀方对子宫复旧不全大鼠子宫内膜细胞凋亡相关蛋白的影响

付水冰 曾晶 谈珍瑜
摘要:目的 观察益气化瘀方对子宫复旧不全大鼠子宫内膜细胞凋亡及Bcl-2、Bax表达的影响,探讨其作用机制。方法 40只分娩后SD大鼠随机分为空白组、模型组、新生化组和益气低、高剂量组。除空白组外,分娩后,将过夜培养的大肠杆菌进行子宫内接种制备大鼠炎症产后子宫复旧不全模型,并于造模后第1-7日分别给予相应药物灌胃。HE染色观察各组大鼠子宫切片病理变化;免疫组化检测子宫内膜组织Bcl-2、Bax蛋白表达。结果 模型组Bcl-2蛋白表达明显低于空白组(P<0.01),Bax蛋白表达明显高于空白组(P<0.01);益气低、高剂量组和新生化组Bcl-2蛋白表达较模型组均明显升高(P<0.01),Bax蛋白表达均明显降低(P<0.01);益气低剂量组Bcl-2蛋白表达较新生化组明显降低(P<0.01),Bax蛋白表达较新生化组明显升高(P<0.01)。结论 益气化瘀方可能通过上调Bcl-2、下调Bax蛋白表达,降低子宫内膜细胞凋亡的发生,促进子宫内膜增生修复,从而促进产后子宫复旧。
关键词:益气化瘀方;子宫内膜复旧不全;细胞凋亡;Bcl-2蛋白;Bax蛋白;大鼠
DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.017
中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2016)02-0059-04
Effects of Yiqi Huayu Decoction on Endometrial Cell Apoptosis Gap-associated Protein in Rat Models of Incomplete Puerperal Involution of Uterus FU Shui-bing1, ZENG Jing2, TAN Zhen-yu2 (1. Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China; 2. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410007, China)
Abstract: Objective To investigate the effects of Yiqi Huayu Decoction on cell apoptosis and Bcl-2, Bax expressions of incomplete puerperal involution of uterus; To discuss its mechanism of action. Methods Forty SD rats were randomly divided into normal group, model group, Xinshenghua group, high- and lower-dose Yiqi groups. The first day after delivery, except for the normal group, rats received intrauterine inoculation with overnight cultured diluted E. coli to establish rat models with incomplete puerperal involution of uterus. They were given corresponding medicine for gavage during day 1-7 after the modeling. Pathological changes in rat uterus slice were observed by HE staining in each group; immunohistochemical detection was used to detect protein expressions of Bcl-2 and Bax in endometrial tissue. Results The protein expression of Bcl-2 in the model group was lower than that in the normal group (P<0.01), and protein expression of Bax in the model group was higher than that in the normal group (P<0.01). The protein expression of Bcl-2 in the high- and lower-dose Yiqi groups and Xinshenghua group was higher than that in the model group (P<0.01), and protein expression of Bax in the high- and lower-dose Yiqi groups and Xinshenghua group was lower than that in the model group (P<0.01). The protein expression of Bcl-2 in the lower-dose Yiqi group was lower than that in Xinshenghua group (P<0.01), and protein expression of Bax in the lower-dose Yiqi group was higher than that in Xinshenghua group (P<0.01). Conclusion Yiqi Huayu Decoction can promote the repair of endometrial hyperplasia and postpartum uterine involution through up-regulating Bcl-2 protein expression and down-regulating Bax protein expression, and reducing the incidence of endometrial cell apoptosis.
Key words: Yiqi Huayu Decoction; incomplete puerperal involution of uterus; apoptosis; Bcl-2; Bax; rats
基金项目:国家自然科学基金青年基金(81202848);湖南省自然科学基金(14JJ3121)
通讯作者:曾晶,E-mail:841825639@qq.com
近年来,由于人工流产、剖宫产、引产率的上升,随之发生的慢性子宫内膜炎升高,子宫复旧不全的发生率上升,导致产后大出血或者晚期产后出血时有发生,给产妇造成巨大身体和心理创伤。细胞凋亡是机体一种清除受损、老化异常细胞的生理过程,存在于生命生长发育的各个时期,包括子宫内膜的周期性变化。子宫内膜能否维持周期性变化和功能稳定的关键原因在于细胞凋亡的调控。子宫内膜细胞凋亡使子宫内膜发生周期性的脱落,从而维持子宫内膜的生理作用。益气化瘀方是湖南中医药大学尤昭玲教授治疗产后复旧不良的经验方。前期实验表明,益气化瘀方能降低产后血清中一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)水平,抑制子宫螺旋动脉异常舒张,促进子宫内膜的重建与修复[1]。本实验通过观察益气化瘀方对产后子宫复旧不全大鼠子宫内膜细胞凋亡相关蛋白Bcl-2及Bax表达的影响,探讨其是否通过干预细胞调亡促进产后子宫复旧。
1 实验材料
1.1 动物
SPF级3月龄SD大鼠70只,其中雌鼠50只、雄鼠20只,体质量180~220 g,湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供,许可证号SCXK(湘)2011-0003,饲养于湖南中医药大学SPF级动物实验室。
1.2 药物
益气化瘀方由党参15 g、黄芪15 g、蒲黄10 g、鹿衔草10 g、马鞭草10 g、茜草10g、乌药10 g、狗脊10 g、续断10 g、甘草6 g等组成,饮片均购自湖南中医药大学第一附属医院,浸膏浓度为4.43 g原药材/g,批号20120328,灭菌后置于4 ℃冰箱保存备用。新生化颗粒,云南白药集团股份有限公司,批号ZLB1304,临床用量36 g/d。
1.3 主要试剂与仪器
大肠杆菌ATCC25922(湖南中医药大学实验中心),HE染色液、饱和苦味酸(南京建成生物试剂有限公司),Bax、Bcl-2免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术公司),4%多聚甲醛(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司),10%水合氯醛(天津市科密欧化统一制剂)。YJ-450型超净工作台(苏州进化设备有限公司),MDF-U5411型超低温冰箱(三洋公司),LEICADMLB2型双目显微镜(德国LEICA公司)。
2 实验方法
2.1 造模、分组与给药
分娩后SD大鼠40只,按体质量由高到低进行分层,选取随机数字表中任意一行数字进行分组,随机分为空白组、模型组、新生化组和益气低、高剂量组,每组8只。参考文献[2]方法,造模大鼠进行子宫内接种大肠杆菌(稀释成1.0×107个/mL),子宫接种量为0.2 mL。造模后第2日随机处死1只雌鼠,行子宫切片提示子宫复旧不良,子宫黏膜充血、出血,雌激素水平低,并有大量炎性细胞浸润,表明造模成功。益气低、高剂量组分别于造模后第1日开始,每日灌胃相应剂量益气化瘀方水煎液,相当于成人等效剂量的1、2倍,灌胃体积为8 mL/(kg·d);新生化组给予5.4 g/kg新生化颗粒灌胃;模型组和空白组给予等量蒸馏水灌胃。每日1次,连续7 d。
2.2 病理学观察
HE染色镜下观察其病理变化。主要步骤:取材,固定后石蜡包埋,4 μm切片,脱蜡(二甲苯2×5 min);乙醇水化至水洗;苏木素浸染5 min,蒸馏水洗片刻;分化液(盐酸乙醇)5~30 s,蒸馏水冲洗1 min;伊红染色30 s,蒸馏水冲洗30 s;乙醇脱水;二甲苯透明2×2 min;中性树脂封片,避免产生气泡。
2.3 免疫组化检测子宫内膜组织Bcl-2、Bax表达
末次灌胃2 h采血后脱颈处死大鼠。将取出的子宫组织切片,经二甲苯2×10 min,依次经梯度乙醇后入水;pH 7.4 PBS冲洗3次;新配制甲醇和H202阻断内源性过氧化酶,室温孵育10 min,PBS洗涤3次;0.01 mol/L枸橼酸修复液煮沸,停止加热,再用蒸馏水冲洗缸子,加速冷却至室温约15 min,PBS洗涤3次;加入适合比例的一抗(兔抗鼠Bax、Bcl-2),置于4 ℃冰箱过夜;滴加生物素化二抗,恒温箱内孵育约30 min,PBS冲洗3次;使用前配制DAB溶液,30 min内使用;滴加DAB显色液,镜下控制反应至背景显色5 min;蒸馏水充分冲洗;苏木精浅染后,蒸馏水冲洗干净;各级梯度乙醇分别脱水5 min;二甲苯中透明中性树脂封片,防止气泡发生。光镜观察并拍照。以已知的Bcl-2阳性图片作阳性对照。细胞核棕黄色为阳性反应细胞。免疫组化染色随机观察5个不重叠视野,应用医学数码图像仪分析计算Bcl-2、Bax灰度值,取平均值作为大鼠的检测值。
3 统计学方法
采用SPSS21.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示。所有计量料资若满足正态分布,符合方差性齐采用方差分析,方差不齐时采用非参数秩和方法检验。P<0.05表示差异有计统学意义。
4 结果
4.1 子宫内膜组织HE染色结果
空白组大鼠子宫内膜偶有连续性部分间断,上皮细胞轻度脱落,腺体数目少;模型组与空白组比较,子宫内膜连续性部分中断,且子宫内膜部分小血管扩张、充血,上皮细胞坏死脱落,大量炎性细胞浸润,间质疏松水肿;新生化组和益气高剂量组子宫内膜连续性好,未见中断,无明显上皮损伤,未见明显炎性细胞浸润,腺体数目多,未见血管扩张、充血,间质致密,宫腔中无明显渗血、渗液;益气低剂量组子宫内膜可见少量连续性中断,内膜上皮损伤较轻,间质较致密,炎细胞少。结果见图1。
4.2 益气化瘀方对大鼠子宫内膜细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的影响
与空白组比较,模型组Bcl-2蛋白表达明显下降、Bax蛋白表达升高(P<0.01);与模型组比较,益气低、高剂量组及新生化组Bcl-2蛋白表达升高、Bax蛋白表达降低(P <0.01);与新生化组比较,益气低剂量组Bcl-2蛋白表达降低、Bax蛋白表达升高(P<0.01),益气高剂量组Bcl-2、Bax蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。结果见图2、图3、表1。
5 讨论
程序化细胞死亡也被称为细胞凋亡,指细胞通过凋亡信号刺激时,启动细胞内死亡机制,通过一系列信号传播,最后演变为高度有序的细胞死亡。在正常生理过程,细胞凋亡维持着动态平衡。若细胞凋亡动态平衡失去控制,导致细胞过度增生或凋亡,可引起子宫内膜异位症、卵巢癌等[3]。Bcl-2和Bax蛋白分别是Bcl-2基因家族中最有代表性的凋亡抑制因子和凋亡促进因子,且Bax还参与调控Bcl-2的活性。近年来研究表明,子宫内膜存在细胞凋亡并受凋亡调节因子的调控[4]。子宫内膜细胞凋亡和增生保持动态平衡,使子宫内膜保持周期性变化,从而维持子宫内膜的生理作用。子宫内膜的周期性生长和重建与细胞凋亡密切相关。Bax蛋白主要诱导细胞凋亡,抑制内膜过度增生;Bcl-2蛋白则抑制细胞凋亡,促进细胞增殖,内膜修复增生[5-6]。
根据其临床表现,产后子宫复旧不全可其归于中医“产后恶露不绝”范畴,又称“恶露不止”。唐代孙思邈《备急千金要方》曰:“妇人产后,五脏皆羸弱。”宋代陈自明《妇人大全良方》云:“产后脏腑劳伤,气血虚损……致恶露不下。”清代阎纯玺《胎产心法》有言:“产时耗伤气血经络,气虚不能收敛,或者瘀血不去,新血难归经,相并而下,日久难以止住。”产后恶露淋漓不绝与气虚无力摄血或瘀血内阻等有关,产后气虚摄血无力可致恶露不绝,瘀血内阻、血不归经也可使恶露不绝。其病机为瘀血阻滞胞宫、冲任,不能归经,离经之血致恶露不绝。对于产后疾病的原因,历代医家大多着眼于产后气血亏虚、瘀血内阻这一内因。
益气化瘀方以益气化瘀、扶正祛邪为法,功专益气摄血、化瘀止痛,虚实标本兼治,且化瘀不耗气、止血不留瘀,是治疗产后恶露不尽、阴道不规则流血、小腹疼痛的良方。党参和蒲黄为方中君药。党参味甘,补益脾肺、生津;蒲黄味甘微辛、味平,活血化瘀、止血;黄芪、马鞭草、茜草共为臣药。黄芪味甘、性微温,补气升阳、益卫固表;马鞭草味苦、性凉,活血化瘀;茜草味苦、性寒,凉血止血、祛瘀通经。鹿衔草、乌药、狗脊、续断同为佐药。鹿衔草味甘、苦,性温,祛风除湿、补肾强骨、止血;乌药味辛、性温,顺气止痛、温肾散寒;狗脊味甘、苦,性温,补肝肾、强腰膝、止血;续断味苦、甘、辛,性微温、补肝肾、强筋骨、止血。甘草为使药,味甘、性平,补脾益气、清热解毒、解痉止痛,调和方中诸药。诸药合用,扶正祛邪、益气化瘀,使补益不碍邪,化瘀不伤正,从而促进恶露尽快排出,并且补益气血,促进产后恢复。
本实验免疫组化结果显示,益气化瘀方可降低产后子宫复旧不良大鼠子宫内膜损伤程度,修复子宫内膜,促进产后子宫复旧。此作用可能通过上调Bcl-2、下调Bax蛋白表达,降低子宫内膜细胞凋亡的发生而实现的。
参考文献:
[1] 张秀丽,曾晶,付水冰,等.益气化瘀方对产后子宫复旧不全大鼠一氧化氮和一氧化氮合酶的影响[J].中国中医药信息杂志,2015,22(6):58-60.
[2] 赵红琼,简子健,姚刚,等.建立大鼠实验性子宫内膜炎模型的探讨[J].新疆农业大学学报,2008,31(3):5.
[3] NASU K, NISHIDA M, KAWANO Y, et al. Aberrant expression of apoptosis-related molecules in endometriosis:a possible mechanism underlying the pathogenesis of endometriosis[J]. Reprod Sci,2011,18(3):206-218.
[4] 卢宁,佟继铭,刘梦杰.大黄水提物对成年雌性大鼠子宫中Bcl-2、Bax 表达的影响[J].时珍国医国药,2014,25(7):1605-1606.
[5] 周华,齐聪,吴卿.补肾活血法对子宫内膜异位症模型大鼠细胞凋亡基因Bcl2/Bax的影响[J].上海中医药大学学报,2012,26(6):96-99.
[6] KONON H, YAMAKAWA H, UTSUNOMIYA H, et a1. Expression of survivin and bcl-2 in the normal humen endometrium[J]. Mol Hum Reprod, 2000,6(6):529.
(收稿日期:2015-05-13)
(修回日期:2015-06-07;编辑:华强)
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