平痤洗剂皮肤刺激和过敏性实验研究
李彦林 周云丰 李琳 王丽丽 陈曦 许扬?
摘要：目的 观察平痤洗剂外用对动物皮肤的刺激性和过敏性反应。方法 皮肤刺激反应实验选用新西兰大耳白家兔，分为完整皮肤组和破损皮肤组，2组分别在背部两侧的脱毛处涂以蒸馏水和平痤洗剂，观察皮肤的刺激反应并进行评分。皮肤过敏反应实验选用白色豚鼠，分为蒸馏水组、平痤洗剂组和阳性对照组，分别在背部脱毛处涂以蒸馏水、平痤洗剂和2，4-二硝基氯苯，观察皮肤过敏反应并进行评分。结果 平痤洗剂对家兔完整皮肤无刺激性作用，豚鼠皮肤无过敏反应。结论 平痤洗剂外用具有较高的安全性。
关键词：平痤洗剂；皮肤刺激性；皮肤过敏性；动物实验
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.016
中图分类号：R285.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）02-0056-03
Experimental Study on Skin Irritation and Allergic Reaction of Pingcuo Lotion LI Yan-lin， ZHOU Yun-feng， LI Lin， WANG Li-li， CHEN Xi， XU Yang （Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences， Beijing 100193， China）
Abstract： Objective To evaluate the skin irritation and allergic reaction of external use of Pingcuo Lotion on animal skin. Methods Skin irritation test was carried out on New Zealand white rabbits. All animal were divided into intact skin and damaged skin groups， and distilled water or Pingcuo Lotion were applied to the two groups on the two sides of shaved rabbit back skin. Skin irritation was observed and scored. Skin allergy test were performed on healthy white guinea pigs. All animal were divided into distilled water， Pingcuo Lotion and positive groups， and the three groups were treated with distilled water， Pingcuo Lotion and 2，4-Dinitrochlorobenzene respectively on the shaved back skin. Skin allergic reaction was observed and scored. Results Pingcuo Lotion did not induce any dermal irritation in New Zealand white rabbits. Skin allergic reaction was not found in guinea pigs. Conclusion External use of Pingcuo Lotion on the animal skin is safe.
Key words： Pingcuo Lotion； skin irritation； skin allergic reaction； animal experiment
外用中药如粉剂、酊剂、膏剂等，因其外涂于皮
基金项目：国家科技重大专项-重大新药创制（2014ZX09201022-006）；中国医学科学院药用植物研究所创新团队发展计划项目（IT1305）
通讯作者：许扬，E-mail：vascular888@126.com
肤或黏膜，使用方便，在皮肤病的治疗中应用较多。但是，近年来不断发生的以皮肤过敏反应为主的临床事件给外用中药的安全性提出了必须正视的问题[1]。2005年，国家食品药品监督管理局发布了中药及化学药物皮肤刺激及过敏性研究技术指导原则[2-3]，为外用药物的安全性研究提供了权威的方法和标准。平痤
洗剂为临床治疗痤疮的外用方，具有使用方便、价廉、疗效高的特点[4]。为了验证本方的安全性，进一步推广本方在临床上的应用，本实验对平痤洗剂的皮肤刺激性、皮肤过敏性进行了系统研究。
1 材料与方法
1.1 动物
新西兰大耳白家兔48只，3月龄，体质量2.0～2.5 kg，雌雄各半，北京金牧阳实验动物养殖有限责任公司，许可证号SCXK（京）2010-0001。白色豚鼠30只，2月龄，雌雄各半，体质量350～450 g，北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号SCXK（京）2009-0004。上述动物均饲养于本所普通环境动物房。
1.2 药物
平痤洗剂由苦参、牡丹皮、龙胆、蒲公英、金刚藤各30 g，地肤子、大青叶各20 g组成，所有饮片购于北京同仁堂药店，经本所邹忠梅研究员鉴定，符合2010年版《中华人民共和国药典》标准。将上述中药加5倍量蒸馏水浸泡1 h后煎煮，煮沸30 min后过滤，药渣再加等量蒸馏水煎煮过滤。将2次药液混合后，用旋转蒸发仪浓缩成含原药材1 g/mL样品。
1.3 试剂
硫化钠（天津市恒兴化学试剂制造有限公司，分析纯），实验时用蒸馏水配制成浓度为8%硫化钠水溶液，避光密封保存；2，4-二硝基氯苯成都西亚试剂有限公司（分析纯），实验时用分析纯级丙酮配制成1% 2，4-二硝基氯苯和0.1% 2，4-二硝基氯苯，避光密封保存。
1.4 皮肤刺激实验
1.4.1 分组与给药 实验开始前家兔饲养7 d，观察摄食和行为，完全无异常后按雌雄、体质量随机分组，单次给药组及多次给药组均设2组，分别为完整皮肤组及破损皮肤组，每组6只。单次给药：实验前1 d，背部脊柱两侧剪毛，8%硫化钠溶液脱毛，去毛范围每侧约3 cm×3 cm。完整皮肤组保证皮肤无损伤，破损皮肤组采用16号针头，在脱毛且消毒皮肤上划“#”字，以皮肤渗血为度，左右两侧皮肤损伤程度基本一致。家兔右侧脱毛区涂以0.5 mL平痤洗剂，左侧脱毛区涂以蒸馏水0.5 mL作为对照，用两层无菌纱布覆盖，再盖以聚乙烯薄膜，以无刺激性医用胶布固定。24 h后，去除覆盖物，温水清除受试物，肉眼观察去除受试物后1、24、48、72 h的局部情况，记录涂药处有无红斑和水肿等情况。多次给药：实验及观察方法同单次给药实验，每日给药1次，连续7 d，去除受试物1、24、48、72 h后肉眼观察给药局部情况，记录各组受试物平均反应分值，判断刺激强度。
1.4.2 刺激强度评分标准 根据国家食品药品监督管理局制定的相关技术指导原则[2-3]，按表1、表2评分标准计分并判断刺激强度。
1.5 皮肤过敏性实验
1.5.1 分组及给药 白色豚鼠随机分为蒸馏水组、平痤洗剂组和阳性对照组（1% 2，4-二硝基氯苯组），每组10只。实验前24 h，8%硫化钠溶液将豚鼠背部脊柱两侧脱毛，去毛范围每侧约3 cm×3 cm，24 h后致敏接触。致敏接触：取蒸馏水和平痤洗剂0.2 mL及1% 2，4-二硝基氯苯液0.2 mL，分别涂在各组动物背部右侧脱毛区，二层纱布覆盖，再以无刺激胶布封闭固定，持续6 h。第7、14日以同样方法重复1次，共3次。激发接触：于末次给药14 d后，取蒸馏水及平痤洗剂各0.2 mL及0.1% 2，4-二硝基氯苯液0.2 mL，分别涂在各组动物背部左侧脱毛区，2层纱布覆盖，再以无刺激的医用胶布封闭固定，持续6 h。6 h后去除受试药物，观察0、24、48、72 h的过敏反应情况。
1.5.2 过敏程度评分 按皮肤过敏反应程度评分标准评价各组豚鼠皮肤过敏反应分值（见表3），计算致敏反应发生率（出现红斑和水肿动物例数÷受试动物总数×100%）及平均反应分值[（红斑形成总分+水肿形成总分）÷动物总数]。判断受试豚鼠对受试样品的过敏程度（见表4）。
2 结果
2.1 皮肤刺激实验
2.1.1 单次给药 完整皮肤组在去除受试药物后1、24、48、72 h，肉眼观察均无明显红斑、水肿等皮肤刺激反应；破损皮肤组给予受试物24 h后继续观察1 h，给药侧和对照侧均可见划伤部位有轻微红肿，至24 h消失，后续观察未再发现异常。皮肤刺激评分结果表明，平痤洗剂与蒸馏水单次给药对完整皮肤与损伤皮肤的反应分值无明显差异，见表5。
2.1.2 多次给药 完整皮肤组多次给药过程中未见皮肤有红斑、水肿等异常反应，破损皮肤组给予平痤洗剂及蒸馏水时，给药第1日给药侧和对照侧均可见划伤部位红肿，至第3日完全恢复，其后每次去除药物后1 h及再次给药前，末次给药后1、24、48、72 h，肉眼观察均未见有红斑、水肿等情况，见表6。停药后继续观察1周，给药部位未出现局部色素沉着、出血点、皮肤粗糙或变薄等情况。
2.2 皮肤过敏实验
阳性对照组自激发给药6 h后，受试区出现轻度红斑，无水肿，致敏率100%，为极度致敏性；平痤洗剂组和蒸馏水组在整个观察过程中；未见受试区出现红斑及水肿，致敏率为0，属弱致敏性，见表7。
3 讨论
中药外用为传统中医药治疗疾病尤其是皮肤疾病的重要手段，但近年来外用中药过敏的临床事件时有发生。从已发表的文献看，中药致皮肤过敏反应的类型有接触性皮炎、局部皮肤刺激、光毒性及光变应性皮炎、系统性接触性反应等类型，引起这些反应的中药既有单味药，也有复方制剂[1，5]。在单味药方面，赵氏等[6]综合了近30年的文献报道，归纳出具有明显皮肤不良反应的单味中药达50种之多，这些中药外用有的引起局部过敏反应，有的引起全身过敏反应，严重者甚至中毒致死。因此，对于外用中药的安全性评价，有必要针对每种中药进行系统的实验研究。
平痤洗剂由苦参、牡丹皮、龙胆、蒲公英、金刚藤、地肤子、大青叶共7味中药组成。从各药物的功效方面看，均无明显毒性和刺激性。同时，对比已经报道的文献，也未发现平痤洗剂组方中含有引起皮肤过敏反应的单味中药。但作为复方的外用制剂，是否引起皮肤的刺激和过敏反应尚未见报道。为了确证其安全性，根据国家食品药品监督管理局发布的技术指导原则[2-3]，本实验研究了平痤洗剂对家兔的皮肤刺激和豚鼠的皮肤过敏反应。结果显示，平痤洗剂对完整皮肤无刺激性及致敏作用，实验中虽发现平痤洗剂对破损皮肤有短暂轻度刺激作用，但这种作用随时间延长而消失。
参考文献：
[1] 杨亚辉，胡祥宇，杨文信.常用中药引起皮肤过敏反应的研究近况[J].西南军医，2010，12（6）：1154-1155.
[2] 国家食品药品监督管理局.中药、天然药物刺激性和溶血性研究的技术指导原则[M].2005.
[3] 国家食品药品监督管理局.化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则[M].2005.
[4] 张傲清，黄丽珍.中药熏洗法治疗寻常型痊疮疗效观察[J].临床皮肤科杂志，1995，24（5）：326.
[5] 张立坤，竺炯，史万忠，等.中药外用致皮肤过敏反应分析[J].河北中医，2011，33（11）：1736-1739.
[6] 赵姣，张会宗，李国信.中药外用药物不良反应现况分析[J].中国中医药信息杂志，2015，22（4）：132-136.
（收稿日期：2015-07-10；编辑：华强）
摘要：目的 观察平痤洗剂外用对动物皮肤的刺激性和过敏性反应。方法 皮肤刺激反应实验选用新西兰大耳白家兔，分为完整皮肤组和破损皮肤组，2组分别在背部两侧的脱毛处涂以蒸馏水和平痤洗剂，观察皮肤的刺激反应并进行评分。皮肤过敏反应实验选用白色豚鼠，分为蒸馏水组、平痤洗剂组和阳性对照组，分别在背部脱毛处涂以蒸馏水、平痤洗剂和2，4-二硝基氯苯，观察皮肤过敏反应并进行评分。结果 平痤洗剂对家兔完整皮肤无刺激性作用，豚鼠皮肤无过敏反应。结论 平痤洗剂外用具有较高的安全性。
关键词：平痤洗剂；皮肤刺激性；皮肤过敏性；动物实验
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.016
中图分类号：R285.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）02-0056-03
Experimental Study on Skin Irritation and Allergic Reaction of Pingcuo Lotion LI Yan-lin， ZHOU Yun-feng， LI Lin， WANG Li-li， CHEN Xi， XU Yang （Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences， Beijing 100193， China）
Abstract： Objective To evaluate the skin irritation and allergic reaction of external use of Pingcuo Lotion on animal skin. Methods Skin irritation test was carried out on New Zealand white rabbits. All animal were divided into intact skin and damaged skin groups， and distilled water or Pingcuo Lotion were applied to the two groups on the two sides of shaved rabbit back skin. Skin irritation was observed and scored. Skin allergy test were performed on healthy white guinea pigs. All animal were divided into distilled water， Pingcuo Lotion and positive groups， and the three groups were treated with distilled water， Pingcuo Lotion and 2，4-Dinitrochlorobenzene respectively on the shaved back skin. Skin allergic reaction was observed and scored. Results Pingcuo Lotion did not induce any dermal irritation in New Zealand white rabbits. Skin allergic reaction was not found in guinea pigs. Conclusion External use of Pingcuo Lotion on the animal skin is safe.
Key words： Pingcuo Lotion； skin irritation； skin allergic reaction； animal experiment
外用中药如粉剂、酊剂、膏剂等，因其外涂于皮
基金项目：国家科技重大专项-重大新药创制（2014ZX09201022-006）；中国医学科学院药用植物研究所创新团队发展计划项目（IT1305）
通讯作者：许扬，E-mail：vascular888@126.com
肤或黏膜，使用方便，在皮肤病的治疗中应用较多。但是，近年来不断发生的以皮肤过敏反应为主的临床事件给外用中药的安全性提出了必须正视的问题[1]。2005年，国家食品药品监督管理局发布了中药及化学药物皮肤刺激及过敏性研究技术指导原则[2-3]，为外用药物的安全性研究提供了权威的方法和标准。平痤
洗剂为临床治疗痤疮的外用方，具有使用方便、价廉、疗效高的特点[4]。为了验证本方的安全性，进一步推广本方在临床上的应用，本实验对平痤洗剂的皮肤刺激性、皮肤过敏性进行了系统研究。
1 材料与方法
1.1 动物
新西兰大耳白家兔48只，3月龄，体质量2.0～2.5 kg，雌雄各半，北京金牧阳实验动物养殖有限责任公司，许可证号SCXK（京）2010-0001。白色豚鼠30只，2月龄，雌雄各半，体质量350～450 g，北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号SCXK（京）2009-0004。上述动物均饲养于本所普通环境动物房。
1.2 药物
平痤洗剂由苦参、牡丹皮、龙胆、蒲公英、金刚藤各30 g，地肤子、大青叶各20 g组成，所有饮片购于北京同仁堂药店，经本所邹忠梅研究员鉴定，符合2010年版《中华人民共和国药典》标准。将上述中药加5倍量蒸馏水浸泡1 h后煎煮，煮沸30 min后过滤，药渣再加等量蒸馏水煎煮过滤。将2次药液混合后，用旋转蒸发仪浓缩成含原药材1 g/mL样品。
1.3 试剂
硫化钠（天津市恒兴化学试剂制造有限公司，分析纯），实验时用蒸馏水配制成浓度为8%硫化钠水溶液，避光密封保存；2，4-二硝基氯苯成都西亚试剂有限公司（分析纯），实验时用分析纯级丙酮配制成1% 2，4-二硝基氯苯和0.1% 2，4-二硝基氯苯，避光密封保存。
1.4 皮肤刺激实验
1.4.1 分组与给药 实验开始前家兔饲养7 d，观察摄食和行为，完全无异常后按雌雄、体质量随机分组，单次给药组及多次给药组均设2组，分别为完整皮肤组及破损皮肤组，每组6只。单次给药：实验前1 d，背部脊柱两侧剪毛，8%硫化钠溶液脱毛，去毛范围每侧约3 cm×3 cm。完整皮肤组保证皮肤无损伤，破损皮肤组采用16号针头，在脱毛且消毒皮肤上划“#”字，以皮肤渗血为度，左右两侧皮肤损伤程度基本一致。家兔右侧脱毛区涂以0.5 mL平痤洗剂，左侧脱毛区涂以蒸馏水0.5 mL作为对照，用两层无菌纱布覆盖，再盖以聚乙烯薄膜，以无刺激性医用胶布固定。24 h后，去除覆盖物，温水清除受试物，肉眼观察去除受试物后1、24、48、72 h的局部情况，记录涂药处有无红斑和水肿等情况。多次给药：实验及观察方法同单次给药实验，每日给药1次，连续7 d，去除受试物1、24、48、72 h后肉眼观察给药局部情况，记录各组受试物平均反应分值，判断刺激强度。
1.4.2 刺激强度评分标准 根据国家食品药品监督管理局制定的相关技术指导原则[2-3]，按表1、表2评分标准计分并判断刺激强度。
1.5 皮肤过敏性实验
1.5.1 分组及给药 白色豚鼠随机分为蒸馏水组、平痤洗剂组和阳性对照组（1% 2，4-二硝基氯苯组），每组10只。实验前24 h，8%硫化钠溶液将豚鼠背部脊柱两侧脱毛，去毛范围每侧约3 cm×3 cm，24 h后致敏接触。致敏接触：取蒸馏水和平痤洗剂0.2 mL及1% 2，4-二硝基氯苯液0.2 mL，分别涂在各组动物背部右侧脱毛区，二层纱布覆盖，再以无刺激胶布封闭固定，持续6 h。第7、14日以同样方法重复1次，共3次。激发接触：于末次给药14 d后，取蒸馏水及平痤洗剂各0.2 mL及0.1% 2，4-二硝基氯苯液0.2 mL，分别涂在各组动物背部左侧脱毛区，2层纱布覆盖，再以无刺激的医用胶布封闭固定，持续6 h。6 h后去除受试药物，观察0、24、48、72 h的过敏反应情况。
1.5.2 过敏程度评分 按皮肤过敏反应程度评分标准评价各组豚鼠皮肤过敏反应分值（见表3），计算致敏反应发生率（出现红斑和水肿动物例数÷受试动物总数×100%）及平均反应分值[（红斑形成总分+水肿形成总分）÷动物总数]。判断受试豚鼠对受试样品的过敏程度（见表4）。
2 结果
2.1 皮肤刺激实验
2.1.1 单次给药 完整皮肤组在去除受试药物后1、24、48、72 h，肉眼观察均无明显红斑、水肿等皮肤刺激反应；破损皮肤组给予受试物24 h后继续观察1 h，给药侧和对照侧均可见划伤部位有轻微红肿，至24 h消失，后续观察未再发现异常。皮肤刺激评分结果表明，平痤洗剂与蒸馏水单次给药对完整皮肤与损伤皮肤的反应分值无明显差异，见表5。
2.1.2 多次给药 完整皮肤组多次给药过程中未见皮肤有红斑、水肿等异常反应，破损皮肤组给予平痤洗剂及蒸馏水时，给药第1日给药侧和对照侧均可见划伤部位红肿，至第3日完全恢复，其后每次去除药物后1 h及再次给药前，末次给药后1、24、48、72 h，肉眼观察均未见有红斑、水肿等情况，见表6。停药后继续观察1周，给药部位未出现局部色素沉着、出血点、皮肤粗糙或变薄等情况。
2.2 皮肤过敏实验
阳性对照组自激发给药6 h后，受试区出现轻度红斑，无水肿，致敏率100%，为极度致敏性；平痤洗剂组和蒸馏水组在整个观察过程中；未见受试区出现红斑及水肿，致敏率为0，属弱致敏性，见表7。
3 讨论
中药外用为传统中医药治疗疾病尤其是皮肤疾病的重要手段，但近年来外用中药过敏的临床事件时有发生。从已发表的文献看，中药致皮肤过敏反应的类型有接触性皮炎、局部皮肤刺激、光毒性及光变应性皮炎、系统性接触性反应等类型，引起这些反应的中药既有单味药，也有复方制剂[1，5]。在单味药方面，赵氏等[6]综合了近30年的文献报道，归纳出具有明显皮肤不良反应的单味中药达50种之多，这些中药外用有的引起局部过敏反应，有的引起全身过敏反应，严重者甚至中毒致死。因此，对于外用中药的安全性评价，有必要针对每种中药进行系统的实验研究。
平痤洗剂由苦参、牡丹皮、龙胆、蒲公英、金刚藤、地肤子、大青叶共7味中药组成。从各药物的功效方面看，均无明显毒性和刺激性。同时，对比已经报道的文献，也未发现平痤洗剂组方中含有引起皮肤过敏反应的单味中药。但作为复方的外用制剂，是否引起皮肤的刺激和过敏反应尚未见报道。为了确证其安全性，根据国家食品药品监督管理局发布的技术指导原则[2-3]，本实验研究了平痤洗剂对家兔的皮肤刺激和豚鼠的皮肤过敏反应。结果显示，平痤洗剂对完整皮肤无刺激性及致敏作用，实验中虽发现平痤洗剂对破损皮肤有短暂轻度刺激作用，但这种作用随时间延长而消失。
参考文献：
[1] 杨亚辉，胡祥宇，杨文信.常用中药引起皮肤过敏反应的研究近况[J].西南军医，2010，12（6）：1154-1155.
[2] 国家食品药品监督管理局.中药、天然药物刺激性和溶血性研究的技术指导原则[M].2005.
[3] 国家食品药品监督管理局.化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则[M].2005.
[4] 张傲清，黄丽珍.中药熏洗法治疗寻常型痊疮疗效观察[J].临床皮肤科杂志，1995，24（5）：326.
[5] 张立坤，竺炯，史万忠，等.中药外用致皮肤过敏反应分析[J].河北中医，2011，33（11）：1736-1739.
[6] 赵姣，张会宗，李国信.中药外用药物不良反应现况分析[J].中国中医药信息杂志，2015，22（4）：132-136.
（收稿日期：2015-07-10；编辑：华强）
