正交试验优选二花青叶抗敏洗剂提取工艺
熊辉 石金敏 周灿 邹青伟 张晓燕
摘要：目的 优选二花青叶抗敏洗剂提取工艺条件。方法 采用L9（34）正交试验设计，以绿原酸、芍药苷含量和干膏得率为评价指标，筛选最佳提取工艺，采用高效液相色谱法测定绿原酸、咖啡酸和芍药苷的含量。结果 正交试验所得最佳提取条件为加8倍量水，提取3次，每次1 h。结论 该提取工艺合理、可行，可用于二花青叶抗敏洗剂中药材的提取。
关键词：提取工艺；正交试验；绿原酸；咖啡酸；芍药苷
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.029
中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）02-0103-03
Optimization of Extraction Technology for Erhuaqingye Kangmin Lotion by Orthogonal Text XIONG Hui， SHI Jin-min， ZHOU Can， ZOU Qing-wei， ZHANG Xiao-yan （Department of Pharmacy of Renmin Hospital， Hubei University of Medicine， Shiyan 442000， China）
Abstract： Objective To optimize extraction technology of Erhuaqingye Kangmin Lotion. Methods L9 （34） orthogonal test was used； Yield of extract， and the contents of chlorogenic acid and paeoniflorin were set as evaluation indexes to screen the optimum extraction technology. The contents of chlorogenic acid， caffeic acid and paeoniflorin were determined by HPLC. Results Optimum extraction technology was as follows： extracting 3 times with 8 times of water for 1 h each time. Conclusion The optimum technology is reasonable and feasible， which can be used for the extraction of Erhuaqingye Kangmin Lotion.
Key words： extraction technology； orthogonal test； chlorogenic acid； caffeic acid； paeoniflorin
二花青叶抗敏洗剂为本院院内制剂，由金银花、蒲公英、野菊花、赤芍、大青叶等8味药组成，具有清热利湿、凉血解毒、祛风止痒功效，临床用于治疗过敏性皮炎。研究表明，金银花[1-2]、蒲公英[3]、野菊花[4]、大青叶等水提物均具有抗过敏作用。因此，本研究采用正交试验法，以绿原酸、芍药苷、咖啡酸和干膏得率作为考察指标，对水提工艺的加水量、提取时间和提取次数进行优选，以确定最佳水提工艺，为该制剂扩大生产提供依据。
1 仪器与试药
日本岛津高效液相色谱仪，包括LC-20AD泵，SIL-20A自动进样器，SPD-M20A紫外检测器；万分之一电子分析天平（FA2004，上海天平仪器厂）；恒温干燥箱（KWY-101型，武汉市武昌实验仪器厂）。
金银花、蒲公英、野菊花、赤芍、大青叶等中药饮片均购自亳州市宏宇中药饮片有限公司，符合2010年版《中华人民共和国药典》（一部）规定；对照品
基金项目：湖北省高等学校创新能力提升计划（2012年）
通讯作者：张晓燕，E-mail：coarff66@126.com
绿原酸（批号110753-201415）、咖啡酸（批号110885- 200102）、芍药苷（批号110736-201438），中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯，娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。
2 方法和结果
2.1 正交试验设计
在预试验基础上，确定加水量、提取时间和提取次数为影响因素，每因素选取3个水平，正交试验因素水平见表1。
2.2 样品的制备
按处方量（515 g原药材）称取金银花、赤芍等药材各9份，分别按相应倍数加水量、提取时间和提取次数进行提取，各组药液分别用纱布过滤后，最后定容至250 mL，备用。
2.3 干膏得率测定
精密吸取药材水煎液20 mL，置于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后，移至烘箱中，105 ℃干燥3 h，移至干燥器中冷却30 min，迅速精密称定质量，计算干膏得率。
2.4 绿原酸、咖啡酸、芍药苷含量测定
2.4.1 色谱条件 色谱柱：Inertsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.02%磷酸水溶液（11∶89）；流速1.0 mL/min；绿原酸和咖啡酸检测波长323 nm，芍药苷检测波长230 nm；柱温40 ℃。理论塔板数按绿原酸、咖啡酸、芍药苷峰计算均不低于3000[5]。
2.4.2 对照品溶液的制备 精密称取绿原酸、咖啡酸、芍药苷对照品适量，分别加水制成每1 mL含30、5、56 μg对照品的溶液，即得绿原酸、咖啡酸、芍药苷对照品溶液。
2.4.3 供试品溶液的制备 精密吸取定容至250 mL的水煎液1 mL，定容至10 mL容量瓶，取续滤液，即得。
2.4.4 线性关系考察 取绿原酸、咖啡酸、芍药苷对照品适量，精密称定，置10 mL量瓶中，加水溶解并添加至刻度，摇匀，用水逐级稀释，分别得绿原酸对照品溶液质量浓度为120、60、30、15、7.5、3.75、1.875 μg/mL，咖啡酸对照品溶液质量浓度为80、40、20、10、5、2.5、1.25 μg/mL，芍药苷对照品溶液质量浓度为450、225、112.5、56.25、28.12、14.06、7.03 μg/mL。精密吸取上述不同浓度的对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积。以进样质量（?g）为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程。绿原酸Y=1.8×107X-19 702，r=0.999 9；咖啡酸Y=3.8×107X-6482.2，r=0.999 9；芍药苷Y=1.1×107X-10 013，r=1.000 0。结果表明，绿原酸、咖啡酸、芍药苷进样量分别在1.875～120 μg、1.25～80 μg、7.03～450 μg之间与峰面积线性关系良好。
2.4.5 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液10 μL，连续进样6次，计算绿原酸、咖啡酸、芍药苷峰面积RSD分别为0.28%、0.93%、0.67%，表明仪器精密度良好。
2.4.6 重复性试验 取同一水煎液，按“2.4.3”项下方法制备6份供试品溶液，测定峰面积，计算绿原酸、咖啡酸、芍药苷含量，RSD分别为0.71%、0.57%、1.4%，表明样品制备方法重复性良好。
2.4.7 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液10 μL，分别于制备后0、2、4、8、12、24 h进样10 μL，测定峰面积，计算RSD分别为0.71%、1.79%、1.02%，表明24 h内供试品溶液稳定性较好。
2.4.8 加样回收率试验 精密吸取同一水煎液6份，精密加入适量绿原酸、咖啡酸、芍药苷，同法制备供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件分别进样分析，进样量10 μL，测定绿原酸、咖啡酸、芍药苷的含量，计算得绿原酸、咖啡酸、芍药苷平均加样回收率分别为100.31%、98.82%、100.25%，RSD分别为0.42%、1.72%、2.39%，表明方法回收率良好。
2.4.9 样品测定 分别取上述各样品溶液10 μL，按“2.4.1”项下色谱条件进行测定。
2.5 正交试验
以绿原酸、咖啡酸、芍药苷含量及干膏得率为评价指标，考察加水量、提取时间和提取次数对水提取工艺的影响。正交试验安排与结果见表2，方差分析见表3。
从方差分析结果可知，煎煮次数为影响水提工艺的重要因素，其次为加水量，煎煮时间影响不大。由直观分析可知，绿原酸最优工艺为A2B2C3，咖啡酸最优工艺为A3B3C3，芍药苷最优工艺为A3B3C3，干膏得率最优工艺为A3B3C3。煎煮时间对4个评价指标均无明显影响，因此，确定最优煎煮时间为1 h；考察加水量时，4个考察指标中只有干膏得率的P<0.10，因此最终选择加水量的最优条件为8倍量水；提取次数对4个考察指标存在明显影响，因此，提取次数确定最优条件为提取3次。综合上述结果，最终确定最佳工艺为：加8倍量水，提取3次，提取时间均为1 h[6]。
2.6 验证试验
按最佳提取工艺制备3批样品，测定样品中绿原酸、咖啡酸、芍药苷含量和干膏得率，结果见表4。说明该工艺稳定可行。
3 讨论
由于组方中药饮片水提物具有明显的抗过敏作用，故采用传统的水提法，以君药（金银花、蒲公英）和臣药（赤芍）的活性成分绿原酸、咖啡酸和芍药苷为检测指标优化水提工艺，而干膏得率是药物治疗疾病的物质基础，故也应作为检测指标。
含量测定流动相的选择曾经尝试乙腈-水（11∶89）、乙腈-0.02%磷酸水（11∶89）、甲醇-0.02%磷酸水（20∶80），发现流动相为乙腈-0.02%磷酸水（11∶89）时，目标色谱峰的分离度、峰形较好，故选择该比例为流动相。
本研究所确定的工艺合理、稳定，可作为二花青叶抗敏洗剂的提取工艺进行生产。
参考文献：
[1] 贺玉琢.金银花抗促过敏作用（2）[J].国际中医中药杂志，2006，28（6）：363.
[2] 李扬，董银卯，孟宏，等.7种中草药提取物抗过敏功效及刺激性研究[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（4）：191-194.
[3] 林云，江林，蒋健，等.蒲公英的药理作用研究进展[J].中国现代中药， 2011，13（8）：42-47.
[4] 郑璐璐，张贵君，王晶娟，等.野菊花药效组分抗炎的生物效应研究[J].天津中医药，2011，28（3）：251-253.
[5] 张洁，曹旭，朱迪，等.蒲薏颗粒提取工艺优选[J].中国医药工业杂志， 2014，45（11）：1031-1065.
[6] 刘丽侠，申林卉，陶遵威.正交试验法优选降糖通络颗粒提取工艺[J].中国中医药信息杂志，2014，21（3）：81-83.
（收稿日期：2015-04-14）
（修回日期：2015-04-24；编辑：陈静）
摘要：目的 优选二花青叶抗敏洗剂提取工艺条件。方法 采用L9（34）正交试验设计，以绿原酸、芍药苷含量和干膏得率为评价指标，筛选最佳提取工艺，采用高效液相色谱法测定绿原酸、咖啡酸和芍药苷的含量。结果 正交试验所得最佳提取条件为加8倍量水，提取3次，每次1 h。结论 该提取工艺合理、可行，可用于二花青叶抗敏洗剂中药材的提取。
关键词：提取工艺；正交试验；绿原酸；咖啡酸；芍药苷
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.029
中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）02-0103-03
Optimization of Extraction Technology for Erhuaqingye Kangmin Lotion by Orthogonal Text XIONG Hui， SHI Jin-min， ZHOU Can， ZOU Qing-wei， ZHANG Xiao-yan （Department of Pharmacy of Renmin Hospital， Hubei University of Medicine， Shiyan 442000， China）
Abstract： Objective To optimize extraction technology of Erhuaqingye Kangmin Lotion. Methods L9 （34） orthogonal test was used； Yield of extract， and the contents of chlorogenic acid and paeoniflorin were set as evaluation indexes to screen the optimum extraction technology. The contents of chlorogenic acid， caffeic acid and paeoniflorin were determined by HPLC. Results Optimum extraction technology was as follows： extracting 3 times with 8 times of water for 1 h each time. Conclusion The optimum technology is reasonable and feasible， which can be used for the extraction of Erhuaqingye Kangmin Lotion.
Key words： extraction technology； orthogonal test； chlorogenic acid； caffeic acid； paeoniflorin
二花青叶抗敏洗剂为本院院内制剂，由金银花、蒲公英、野菊花、赤芍、大青叶等8味药组成，具有清热利湿、凉血解毒、祛风止痒功效，临床用于治疗过敏性皮炎。研究表明，金银花[1-2]、蒲公英[3]、野菊花[4]、大青叶等水提物均具有抗过敏作用。因此，本研究采用正交试验法，以绿原酸、芍药苷、咖啡酸和干膏得率作为考察指标，对水提工艺的加水量、提取时间和提取次数进行优选，以确定最佳水提工艺，为该制剂扩大生产提供依据。
1 仪器与试药
日本岛津高效液相色谱仪，包括LC-20AD泵，SIL-20A自动进样器，SPD-M20A紫外检测器；万分之一电子分析天平（FA2004，上海天平仪器厂）；恒温干燥箱（KWY-101型，武汉市武昌实验仪器厂）。
金银花、蒲公英、野菊花、赤芍、大青叶等中药饮片均购自亳州市宏宇中药饮片有限公司，符合2010年版《中华人民共和国药典》（一部）规定；对照品
基金项目：湖北省高等学校创新能力提升计划（2012年）
通讯作者：张晓燕，E-mail：coarff66@126.com
绿原酸（批号110753-201415）、咖啡酸（批号110885- 200102）、芍药苷（批号110736-201438），中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯，娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。
2 方法和结果
2.1 正交试验设计
在预试验基础上，确定加水量、提取时间和提取次数为影响因素，每因素选取3个水平，正交试验因素水平见表1。
2.2 样品的制备
按处方量（515 g原药材）称取金银花、赤芍等药材各9份，分别按相应倍数加水量、提取时间和提取次数进行提取，各组药液分别用纱布过滤后，最后定容至250 mL，备用。
2.3 干膏得率测定
精密吸取药材水煎液20 mL，置于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后，移至烘箱中，105 ℃干燥3 h，移至干燥器中冷却30 min，迅速精密称定质量，计算干膏得率。
2.4 绿原酸、咖啡酸、芍药苷含量测定
2.4.1 色谱条件 色谱柱：Inertsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.02%磷酸水溶液（11∶89）；流速1.0 mL/min；绿原酸和咖啡酸检测波长323 nm，芍药苷检测波长230 nm；柱温40 ℃。理论塔板数按绿原酸、咖啡酸、芍药苷峰计算均不低于3000[5]。
2.4.2 对照品溶液的制备 精密称取绿原酸、咖啡酸、芍药苷对照品适量，分别加水制成每1 mL含30、5、56 μg对照品的溶液，即得绿原酸、咖啡酸、芍药苷对照品溶液。
2.4.3 供试品溶液的制备 精密吸取定容至250 mL的水煎液1 mL，定容至10 mL容量瓶，取续滤液，即得。
2.4.4 线性关系考察 取绿原酸、咖啡酸、芍药苷对照品适量，精密称定，置10 mL量瓶中，加水溶解并添加至刻度，摇匀，用水逐级稀释，分别得绿原酸对照品溶液质量浓度为120、60、30、15、7.5、3.75、1.875 μg/mL，咖啡酸对照品溶液质量浓度为80、40、20、10、5、2.5、1.25 μg/mL，芍药苷对照品溶液质量浓度为450、225、112.5、56.25、28.12、14.06、7.03 μg/mL。精密吸取上述不同浓度的对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积。以进样质量（?g）为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程。绿原酸Y=1.8×107X-19 702，r=0.999 9；咖啡酸Y=3.8×107X-6482.2，r=0.999 9；芍药苷Y=1.1×107X-10 013，r=1.000 0。结果表明，绿原酸、咖啡酸、芍药苷进样量分别在1.875～120 μg、1.25～80 μg、7.03～450 μg之间与峰面积线性关系良好。
2.4.5 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液10 μL，连续进样6次，计算绿原酸、咖啡酸、芍药苷峰面积RSD分别为0.28%、0.93%、0.67%，表明仪器精密度良好。
2.4.6 重复性试验 取同一水煎液，按“2.4.3”项下方法制备6份供试品溶液，测定峰面积，计算绿原酸、咖啡酸、芍药苷含量，RSD分别为0.71%、0.57%、1.4%，表明样品制备方法重复性良好。
2.4.7 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液10 μL，分别于制备后0、2、4、8、12、24 h进样10 μL，测定峰面积，计算RSD分别为0.71%、1.79%、1.02%，表明24 h内供试品溶液稳定性较好。
2.4.8 加样回收率试验 精密吸取同一水煎液6份，精密加入适量绿原酸、咖啡酸、芍药苷，同法制备供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件分别进样分析，进样量10 μL，测定绿原酸、咖啡酸、芍药苷的含量，计算得绿原酸、咖啡酸、芍药苷平均加样回收率分别为100.31%、98.82%、100.25%，RSD分别为0.42%、1.72%、2.39%，表明方法回收率良好。
2.4.9 样品测定 分别取上述各样品溶液10 μL，按“2.4.1”项下色谱条件进行测定。
2.5 正交试验
以绿原酸、咖啡酸、芍药苷含量及干膏得率为评价指标，考察加水量、提取时间和提取次数对水提取工艺的影响。正交试验安排与结果见表2，方差分析见表3。
从方差分析结果可知，煎煮次数为影响水提工艺的重要因素，其次为加水量，煎煮时间影响不大。由直观分析可知，绿原酸最优工艺为A2B2C3，咖啡酸最优工艺为A3B3C3，芍药苷最优工艺为A3B3C3，干膏得率最优工艺为A3B3C3。煎煮时间对4个评价指标均无明显影响，因此，确定最优煎煮时间为1 h；考察加水量时，4个考察指标中只有干膏得率的P<0.10，因此最终选择加水量的最优条件为8倍量水；提取次数对4个考察指标存在明显影响，因此，提取次数确定最优条件为提取3次。综合上述结果，最终确定最佳工艺为：加8倍量水，提取3次，提取时间均为1 h[6]。
2.6 验证试验
按最佳提取工艺制备3批样品，测定样品中绿原酸、咖啡酸、芍药苷含量和干膏得率，结果见表4。说明该工艺稳定可行。
3 讨论
由于组方中药饮片水提物具有明显的抗过敏作用，故采用传统的水提法，以君药（金银花、蒲公英）和臣药（赤芍）的活性成分绿原酸、咖啡酸和芍药苷为检测指标优化水提工艺，而干膏得率是药物治疗疾病的物质基础，故也应作为检测指标。
含量测定流动相的选择曾经尝试乙腈-水（11∶89）、乙腈-0.02%磷酸水（11∶89）、甲醇-0.02%磷酸水（20∶80），发现流动相为乙腈-0.02%磷酸水（11∶89）时，目标色谱峰的分离度、峰形较好，故选择该比例为流动相。
本研究所确定的工艺合理、稳定，可作为二花青叶抗敏洗剂的提取工艺进行生产。
参考文献：
[1] 贺玉琢.金银花抗促过敏作用（2）[J].国际中医中药杂志，2006，28（6）：363.
[2] 李扬，董银卯，孟宏，等.7种中草药提取物抗过敏功效及刺激性研究[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（4）：191-194.
[3] 林云，江林，蒋健，等.蒲公英的药理作用研究进展[J].中国现代中药， 2011，13（8）：42-47.
[4] 郑璐璐，张贵君，王晶娟，等.野菊花药效组分抗炎的生物效应研究[J].天津中医药，2011，28（3）：251-253.
[5] 张洁，曹旭，朱迪，等.蒲薏颗粒提取工艺优选[J].中国医药工业杂志， 2014，45（11）：1031-1065.
[6] 刘丽侠，申林卉，陶遵威.正交试验法优选降糖通络颗粒提取工艺[J].中国中医药信息杂志，2014，21（3）：81-83.
（收稿日期：2015-04-14）
（修回日期：2015-04-24；编辑：陈静）
