电针对庆大霉素耳中毒豚鼠耳蜗血管纹琥珀酸脱氢酶的影响
康颂建 史献君等
康颂建史献君史永芝曾兆麟
(泰山医学院生理听觉研究室,山东271000;1泰山医学院第一教学医院;2上海中医药大学)
摘要将动物随机分成3组:GE组动物肌肉注射庆大霉素,每天80 mg/kg;针刺组肌肉注射庆大霉素同GE组,每天电针双侧"听宫"、"翳风"、"肾俞"穴1次;对照组动物不做任何处理。以脑干听觉诱发电位(BAEP)和琥珀酸脱氢酶(SDH)组织化学检测为指标。结果:对照组BAEP反应阈无明显变化,耳蜗血管纹SDH染色呈紫蓝色;GE组动物BAEP反应阈明显升高,SDH显色变淡或消失;针刺组BAEP反应阈升高幅度及血管纹SDH显色变化明显低于GE组。结论:电针能减轻GE耳毒性;对耳蜗血管纹SDH有保护作用。
主题词耳蜗/酶学琥珀酸脱氢酶/针灸效应庆大霉素类/毒性电针
针刺治疗耳聋是中医学的传统方法,对药物性耳聋的防治作用已有报道,针刺有保护耳蜗酸性磷酸酶、ATP酶和琥珀酸脱氢酶(Succinate dehydrogenase,SDH)活性,对抗氨基糖甙类抗生素耳毒性的作用[1,2]。针刺能否保护耳蜗血管纹SDH的活性,尚未见报道。本实验主要观察电针对庆大霉素(gentamicin,GE)致聋豚鼠耳蜗血管纹细胞SDH变化的影响。
1材料与方法
1.1实验动物分组选用耳郭反射正常,日龄45～65天,平均53天,体重为250～350 g的健康杂色豚鼠(由泰安生物制品研究所动物园提供),雌雄兼用,随机分成3组:GE组10只,每天肌肉注射GE 80 mg/kg体重,连续注射20天;针刺组14只,肌肉注射GE同GE组,每天注射GE后1h给予针刺1次;对照组5只,不做任何处理,只作为耳蜗血管纹SDH的正常对照。
1.2脑干听觉诱发电位测定用固定装置固定豚鼠,测定清醒状态下的豚鼠脑干听觉诱发电位(BAEP)反应阈。用YJC-A型诱发电位仪测定用药前和用药及针刺后(隔5天测1次)BAEP反应阈。用短声刺激,由声刺激器输入波宽为0.1 ms方波电脉冲经EPL-903型耳机输出,10次/s。放大器通频带为80 Hz～3 kHz,增益2000,叠加200次。引导电极置颅顶部,参考电极及接地电极分别置于同侧和对侧乳突部。测定BAEP反应阈以IV波刚出现时的刺激强度dB值为反应阈值。
1.3针刺针刺动物处于清醒状态,用固定装置固定,针刺穴位参照文献报道的实验动物解剖学与人体穴位相应部位[1],取双侧"听宫"、"翳风"和"肾俞"穴,用电针刺激法(用G 6805-1型针刺治疗仪,青岛华声仪器厂产),连续输出,9次/s;刺激强度以针刺周围组织颤动,动物能忍受为宜,持续刺激15 min,每天8时进行针刺,连续针刺20天。
1.4组织化学检测停止用药和针刺后1天,测定耳蜗血管纹SDH。SDH显示采用硝基蓝四氮盐法,染色程序改变为适合于耳蜗组织显色。作用液配方[3]:0.2 mol/L琥珀酸15 ml,0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(pH为7.4)15 ml,0.1%硝基蓝四氮盐15 ml,上述各液用时混合即可。染色程序:麻醉动物后处死,立即取耳蜗,迅速在蜗尖部钻孔,并将蜗窗和前庭窗开放,用0 ℃ 60%丙酮液灌流固定,用双蒸馏水灌洗后,再灌流37 ℃作用液,然后将耳蜗置于37 ℃作用液中温育1～2 h。将温育后的耳蜗放于10%磷酸缓冲中性甲醛溶液中固定8 h以上,然后按照耳蜗螺旋韧带硬铺片技术做螺旋韧带铺片[4],光镜下观察耳蜗血管纹SDH的变化。标本染色程度用721型分光光度计(上海第三分析仪器厂产)测定吸光度。各组动物SDH的测定都是在严格控制相同条件下进行的。
2结果
2.1BAEP阈变化GE组和针刺组动物在用药后BAEP反应阈分别都发生不同程度的升高;在用药前和用药后20天比较,都有明显差异。在用药后20天组间比较,GE组升高明显,针刺组升高幅度较小,两组间差异显著(P<0.05);对照组动物BAEP反应阈无明显改变(见表1)。2.2组织化学检测光镜下观察正常豚鼠耳蜗螺旋韧带铺片血管纹细胞和毛细血管壁细胞的SDH显色呈深紫蓝色,分布均匀,血管纹细胞及毛细血管壁均能明显辨认,细胞膜及血管壁边界清楚(见副封1,图1),与文献报道一致[4]。GE组耳聋动物耳蜗血管纹细胞SDH显色明显变淡或消失,部分血管纹细胞膜边界模糊(见副封1,图2),表明血管纹细胞和毛细血管壁细胞SDH活性受到抑制,细胞受到不同程度的损害。针刺组耳聋动物血管纹细胞及毛细血管壁细胞SDH显色亦变淡,但较GE组轻,血管纹细胞及毛细血管壁能清楚辨认(见副封1,图3),表明SDH受到轻度抑制,细胞无明显损害。标本的染色程度用分光光度计测定,吸收波长为450 μm,各组标本的吸光度(±s):对照组为0.0261±0.00162;GE组为0.0138±0.00313;针刺组为0.0198±0.00286;GE组和针刺组比较,差异具有非常显著性意义(P<0.01)。
3讨论
氨基糖甙类抗生素是第十七届国际听力学大会明确的18种致聋药物中最重要的一种[5]。因该类抗生素是临床上常用的药物,故引起的耳聋患者仍不断增加,防治其耳毒性仍是一个重要课题。该类抗生素耳毒性机制学说较多,对内耳酶的影响是耳毒性机制之一。Gratacap比较了该类抗生素对豚鼠耳蜗血管纹与螺旋器超微结构的损害,发现毛细胞的损害主要在溶酶体,而血管纹的损害主要在线粒体[6],SDH是线粒体酶(亦称呼吸酶)的标志酶,是催化柠檬酸循环中琥珀酸与延胡酸之间的反应酶,该酶的活性改变反映了线粒体的功能变化[7]。文献报道较多的是氨基糖甙类抗生素对耳蜗毛细胞SDH的抑制作用,对血管纹SDH变化报道较少。本结果表明该类抗生素对血管纹SDH有抑制作用,与文献报道一致[2]。血管纹SDH显色变淡或消失,是由于SDH活性受到抑制,其组织化学反应减弱或中止所致,由此而引起细胞能量代谢障碍,需要能量的功能活动不能正常进行而受到损害。本实验结果显示SDH显色变化与血管纹细胞的损害程度呈平行。临床上针刺治疗耳聋的有效程度报道不同,一般认为对轻度及早期耳毒性抗生素引起的耳聋治疗效果较好[8,9]。本实验结果表明针刺有预防GE耳毒性的作用。针刺防治耳聋的机制是一个非常复杂的问题,目前所知甚少。针刺除能提高大脑听觉中枢的兴奋性外,不能排除对内耳病理过程的康复作用[10]。文献报道针刺有保护耳蜗酸性磷酸酶、ATP酶和SDH的活性已表明存在这种康复功能[1,2]。本实验结果表明电针能减轻GE的耳毒性作用;亦提示电针减轻GE耳毒性与对耳蜗血管纹细胞SDH的保护作用有关。由于电针保护了SDH活性,维持了线粒体的能量代谢功能,保证了细胞的需能功能,降低GE对血管纹细胞的损害,使血管纹的正常功能得以维持。我们以前实验结果表明电针对耳蜗毛细胞的SDH有保护作用[2],能降低GE对耳蜗毛细胞的损害作用。这些实验结果提示保护耳蜗SDH的活性,可能是针刺能降低GE耳毒性的机制之一。
4参考文献
1张毅,董建勇.针刺对豚鼠链霉素致内耳损伤后期耳郭反射阈值ATPase、ACP活性的影响.甘肃中医,1995;8(2):39
2康颂建,曾兆麟,史献君,等.电针对庆大霉素耳中毒豚鼠耳蜗内琥珀脱氢酶的影响.中国中西医结合杂志,1998;18(6):362
3杜卓民.实用组织学技术.北京:人民卫生出版社,1982:322
4孙爱华,王通义,张义声,等.大鼠耳蜗表面标本制备技术.中华耳鼻咽喉科杂志,1988;23(2):90
5葛贤锡.第十七届国际听力学大会简况.国外医学·耳鼻咽喉科学分册,1985;9(5):274
6Gratacap B, Charachon R, Stoeber P. Results of an Ultrastructural Study Comparing Stria Vascularis with Organ of Corti in Guinea Pigs Treated with Kanamy-
cin Acta Otolaryngol.1985;99(3～4):339
7武内忠男,小川和朗主编.朱逢春译.新酶组织学.北京:人民卫生出版社,1983:62
8郑魁山,孟昭敏,郑俊江,等.针刺治疗链霉素中毒性耳聋40例临床观察.中国针灸,1989;9(3):15
9孙德利,刘元亮,方剑乔,等.不同穴位电针治疗卡那霉素中毒性听力损害的实验研究.针刺研究,1995;20(3):62
10史美育,曾兆麟,施建蓉,等.针刺对豚鼠皮层听觉中枢兴奋性的影响.上海针灸杂志,1997;16(3):29
(吸光度由聂恒环老师协助测定,特此致谢)
(修回日期2000-06-16,齐淑兰发稿)
康颂建史献君史永芝曾兆麟
(泰山医学院生理听觉研究室,山东271000;1泰山医学院第一教学医院;2上海中医药大学)
摘要将动物随机分成3组:GE组动物肌肉注射庆大霉素,每天80 mg/kg;针刺组肌肉注射庆大霉素同GE组,每天电针双侧"听宫"、"翳风"、"肾俞"穴1次;对照组动物不做任何处理。以脑干听觉诱发电位(BAEP)和琥珀酸脱氢酶(SDH)组织化学检测为指标。结果:对照组BAEP反应阈无明显变化,耳蜗血管纹SDH染色呈紫蓝色;GE组动物BAEP反应阈明显升高,SDH显色变淡或消失;针刺组BAEP反应阈升高幅度及血管纹SDH显色变化明显低于GE组。结论:电针能减轻GE耳毒性;对耳蜗血管纹SDH有保护作用。
主题词耳蜗/酶学琥珀酸脱氢酶/针灸效应庆大霉素类/毒性电针
针刺治疗耳聋是中医学的传统方法,对药物性耳聋的防治作用已有报道,针刺有保护耳蜗酸性磷酸酶、ATP酶和琥珀酸脱氢酶(Succinate dehydrogenase,SDH)活性,对抗氨基糖甙类抗生素耳毒性的作用[1,2]。针刺能否保护耳蜗血管纹SDH的活性,尚未见报道。本实验主要观察电针对庆大霉素(gentamicin,GE)致聋豚鼠耳蜗血管纹细胞SDH变化的影响。
1材料与方法
1.1实验动物分组选用耳郭反射正常,日龄45～65天,平均53天,体重为250～350 g的健康杂色豚鼠(由泰安生物制品研究所动物园提供),雌雄兼用,随机分成3组:GE组10只,每天肌肉注射GE 80 mg/kg体重,连续注射20天;针刺组14只,肌肉注射GE同GE组,每天注射GE后1h给予针刺1次;对照组5只,不做任何处理,只作为耳蜗血管纹SDH的正常对照。
1.2脑干听觉诱发电位测定用固定装置固定豚鼠,测定清醒状态下的豚鼠脑干听觉诱发电位(BAEP)反应阈。用YJC-A型诱发电位仪测定用药前和用药及针刺后(隔5天测1次)BAEP反应阈。用短声刺激,由声刺激器输入波宽为0.1 ms方波电脉冲经EPL-903型耳机输出,10次/s。放大器通频带为80 Hz～3 kHz,增益2000,叠加200次。引导电极置颅顶部,参考电极及接地电极分别置于同侧和对侧乳突部。测定BAEP反应阈以IV波刚出现时的刺激强度dB值为反应阈值。
1.3针刺针刺动物处于清醒状态,用固定装置固定,针刺穴位参照文献报道的实验动物解剖学与人体穴位相应部位[1],取双侧"听宫"、"翳风"和"肾俞"穴,用电针刺激法(用G 6805-1型针刺治疗仪,青岛华声仪器厂产),连续输出,9次/s;刺激强度以针刺周围组织颤动,动物能忍受为宜,持续刺激15 min,每天8时进行针刺,连续针刺20天。
1.4组织化学检测停止用药和针刺后1天,测定耳蜗血管纹SDH。SDH显示采用硝基蓝四氮盐法,染色程序改变为适合于耳蜗组织显色。作用液配方[3]:0.2 mol/L琥珀酸15 ml,0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(pH为7.4)15 ml,0.1%硝基蓝四氮盐15 ml,上述各液用时混合即可。染色程序:麻醉动物后处死,立即取耳蜗,迅速在蜗尖部钻孔,并将蜗窗和前庭窗开放,用0 ℃ 60%丙酮液灌流固定,用双蒸馏水灌洗后,再灌流37 ℃作用液,然后将耳蜗置于37 ℃作用液中温育1～2 h。将温育后的耳蜗放于10%磷酸缓冲中性甲醛溶液中固定8 h以上,然后按照耳蜗螺旋韧带硬铺片技术做螺旋韧带铺片[4],光镜下观察耳蜗血管纹SDH的变化。标本染色程度用721型分光光度计(上海第三分析仪器厂产)测定吸光度。各组动物SDH的测定都是在严格控制相同条件下进行的。
2结果
2.1BAEP阈变化GE组和针刺组动物在用药后BAEP反应阈分别都发生不同程度的升高;在用药前和用药后20天比较,都有明显差异。在用药后20天组间比较,GE组升高明显,针刺组升高幅度较小,两组间差异显著(P<0.05);对照组动物BAEP反应阈无明显改变(见表1)。2.2组织化学检测光镜下观察正常豚鼠耳蜗螺旋韧带铺片血管纹细胞和毛细血管壁细胞的SDH显色呈深紫蓝色,分布均匀,血管纹细胞及毛细血管壁均能明显辨认,细胞膜及血管壁边界清楚(见副封1,图1),与文献报道一致[4]。GE组耳聋动物耳蜗血管纹细胞SDH显色明显变淡或消失,部分血管纹细胞膜边界模糊(见副封1,图2),表明血管纹细胞和毛细血管壁细胞SDH活性受到抑制,细胞受到不同程度的损害。针刺组耳聋动物血管纹细胞及毛细血管壁细胞SDH显色亦变淡,但较GE组轻,血管纹细胞及毛细血管壁能清楚辨认(见副封1,图3),表明SDH受到轻度抑制,细胞无明显损害。标本的染色程度用分光光度计测定,吸收波长为450 μm,各组标本的吸光度(±s):对照组为0.0261±0.00162;GE组为0.0138±0.00313;针刺组为0.0198±0.00286;GE组和针刺组比较,差异具有非常显著性意义(P<0.01)。
3讨论
氨基糖甙类抗生素是第十七届国际听力学大会明确的18种致聋药物中最重要的一种[5]。因该类抗生素是临床上常用的药物,故引起的耳聋患者仍不断增加,防治其耳毒性仍是一个重要课题。该类抗生素耳毒性机制学说较多,对内耳酶的影响是耳毒性机制之一。Gratacap比较了该类抗生素对豚鼠耳蜗血管纹与螺旋器超微结构的损害,发现毛细胞的损害主要在溶酶体,而血管纹的损害主要在线粒体[6],SDH是线粒体酶(亦称呼吸酶)的标志酶,是催化柠檬酸循环中琥珀酸与延胡酸之间的反应酶,该酶的活性改变反映了线粒体的功能变化[7]。文献报道较多的是氨基糖甙类抗生素对耳蜗毛细胞SDH的抑制作用,对血管纹SDH变化报道较少。本结果表明该类抗生素对血管纹SDH有抑制作用,与文献报道一致[2]。血管纹SDH显色变淡或消失,是由于SDH活性受到抑制,其组织化学反应减弱或中止所致,由此而引起细胞能量代谢障碍,需要能量的功能活动不能正常进行而受到损害。本实验结果显示SDH显色变化与血管纹细胞的损害程度呈平行。临床上针刺治疗耳聋的有效程度报道不同,一般认为对轻度及早期耳毒性抗生素引起的耳聋治疗效果较好[8,9]。本实验结果表明针刺有预防GE耳毒性的作用。针刺防治耳聋的机制是一个非常复杂的问题,目前所知甚少。针刺除能提高大脑听觉中枢的兴奋性外,不能排除对内耳病理过程的康复作用[10]。文献报道针刺有保护耳蜗酸性磷酸酶、ATP酶和SDH的活性已表明存在这种康复功能[1,2]。本实验结果表明电针能减轻GE的耳毒性作用;亦提示电针减轻GE耳毒性与对耳蜗血管纹细胞SDH的保护作用有关。由于电针保护了SDH活性,维持了线粒体的能量代谢功能,保证了细胞的需能功能,降低GE对血管纹细胞的损害,使血管纹的正常功能得以维持。我们以前实验结果表明电针对耳蜗毛细胞的SDH有保护作用[2],能降低GE对耳蜗毛细胞的损害作用。这些实验结果提示保护耳蜗SDH的活性,可能是针刺能降低GE耳毒性的机制之一。
4参考文献
1张毅,董建勇.针刺对豚鼠链霉素致内耳损伤后期耳郭反射阈值ATPase、ACP活性的影响.甘肃中医,1995;8(2):39
2康颂建,曾兆麟,史献君,等.电针对庆大霉素耳中毒豚鼠耳蜗内琥珀脱氢酶的影响.中国中西医结合杂志,1998;18(6):362
3杜卓民.实用组织学技术.北京:人民卫生出版社,1982:322
4孙爱华,王通义,张义声,等.大鼠耳蜗表面标本制备技术.中华耳鼻咽喉科杂志,1988;23(2):90
5葛贤锡.第十七届国际听力学大会简况.国外医学·耳鼻咽喉科学分册,1985;9(5):274
6Gratacap B, Charachon R, Stoeber P. Results of an Ultrastructural Study Comparing Stria Vascularis with Organ of Corti in Guinea Pigs Treated with Kanamy-
cin Acta Otolaryngol.1985;99(3～4):339
7武内忠男,小川和朗主编.朱逢春译.新酶组织学.北京:人民卫生出版社,1983:62
8郑魁山,孟昭敏,郑俊江,等.针刺治疗链霉素中毒性耳聋40例临床观察.中国针灸,1989;9(3):15
9孙德利,刘元亮,方剑乔,等.不同穴位电针治疗卡那霉素中毒性听力损害的实验研究.针刺研究,1995;20(3):62
10史美育,曾兆麟,施建蓉,等.针刺对豚鼠皮层听觉中枢兴奋性的影响.上海针灸杂志,1997;16(3):29
(吸光度由聂恒环老师协助测定,特此致谢)
(修回日期2000-06-16,齐淑兰发稿)
