野生黑茶抗氧化活性研究

    何英姿 王晓 梁传顺 李稳 潘庆松 覃继忠

    

    

    

    摘 要：本文分别用三种不同极性的溶剂（石油醚、乙酸乙酯和正丁醇）提取野生黑茶中抗氧化活性物质，并测定了三种自由基的清除率，与合成抗氧化剂Vc和芦丁进行对比。结果表明：随着野生黑茶提取物浓度的增加，其对DPPH自由基、·OH自由基和超氧阴离子的清除能力逐渐增强，同时发现野生黑茶对DPPH自由基和·OH自由基清除能力都是乙酸乙酯提取物的自由基清除活性较强。黑茶提取物对DPPH自由基·OH自由基的清除率分别到达93.63%和77.85%。而对超氧阴离子自由基则是正丁醇相提取物的自由基清除活力较强，清除率达到42.25%。结论：野生黑茶不同溶剂提取物对三种自由基的清除效果良好，说明其中富含抗氧化活性物质，这为野生黑茶的进一步开发利用提供了参考依据。

    关键词：野生黑茶;极性溶剂;提取物;自由基清除率;抗氧化

    Abstract：In this paper，the antioxidant active substances were extracted from Wild Dark Tea respectively with three different polar solvent（petroleum ether，ethyl acetate and n-butanol）.The scavenging activity was determined on both DPPH，hydroxyl radicals（·OH）and superoxide anion，and was compared with synthetic antioxidant vitamin C and rutin.The results showed that：in the experimental concentration range，with the increase of the extract concentration，the scavenging capacity on DPPH radical，hydroxyl radical and superoxide anion radical gradually increased，and also found that the ethyl acetate extraction of Wild Dark Tea had stronger scavenging capacity on DPPH radical and hydroxyl radicals.The scavenging capacity radical can reach 93.63% and 77.85% respectively.While the scavenging activity on superoxide anion radical was stronger in chloroform extraction，and the radical scavenging rate was 42.25%.In conclusion，the extractions of Wild Dark Tea in different polar solvent had effectively scavenging activity on DPPH radical，hydroxyl radicals and superoxide anion radical.So Wild Dark Tea is rich in antioxidant active substances.These can provide the reference basis for the further development and utilization of Wild Dark Tea.

    Key words：Wild Dark Tea; polar solvent; extract; radical scavenging; antioxidant

    廣西柳州市融水县原始森林里的原生品种茶树，优良的品质和特有的风味受到了很多专家和学者的青睐和高度重视，国家农业部、科技部相继在融水建设“广西元宝山野生茶种质资源原生境保护区”和全国唯一一个“国家茶产业工程技术研发中心，使得本地黑茶产品特色与品质、原始稀缺性、安全性等各方面均表现出得天独厚的自然优势。黑茶的抗氧化活性一直以来备受瞩目。普洱茶作为黑茶的代表被广泛研究。金裕范等[1]对普洱茶清除DPPH自由基的效率进行了测试，发现5个产地的普洱茶均具有能不同程度地清除DPPH自由基，并随产地不同而有差别。有学者[2]研究发现普洱茶对羟基自由基有很好的清除能力。还有学者[3]采用不同的有机溶剂萃取普洱茶提取物，结果发现普洱茶乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物对羟基自由基和DPPH均有较好的清除效果。对于广西柳州市融水县的野生黑茶，未见研究报道。

    本实验采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇提取野生黑茶的抗氧化活性物质，通过测定其自由基清除能力，研究野生黑茶的抗氧化性能，旨在为进一步开发和利用野生黑茶提供参考。

    1 试验材料和方法

    1.1 实验材料

    （1）实验药品试剂。野生黑茶由广西柳州市融水县水融香茶业有限公司提供。DPPH·自由基（二苯代苦味肼基自由基）购于上海楷洋生物技术有限公司，芦丁购于国药集团化学试剂有限公司，乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、PBS缓冲液、邻二氮菲（菲啰啉）、FeSO4·7H2O、去离子水、H2O2，其他试剂均为国产分析纯。

    （2）仪器与设备。手提式高速中药粉碎机、标准筛、分析天平、真空旋转蒸发仪、抽滤装置、紫外可见分光光度计、电热恒温水浴锅、冷冻干燥器、超声波清洗机、调温电热套。

    1.2 实验方法

    （1）样品制备。先将野生黑茶粉碎，用标准筛进行筛选备用[4]。称取野生黑茶粉末两千克，放在95%的乙醇中浸泡几天。过滤浸提液，再用真空旋转蒸发仪减压悬蒸，得总浸膏55.2g。取蒸馏水溶解浸膏，超声溶解后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取所得提取液减压浓缩至浸膏，分别得到石油醚相92545g，乙酸乙酯相17.7129g，正丁醇相221440g，水相44968g。将各样品冷冻干燥后，置于冰箱中保存备用[5]。

    （2）DPPH自由基的清除能力测定。分别将野生黑茶提取液经萃取后的各极性部分浸膏、芦丁和Vc，用无水乙醇配制成浓度为1mg/mL的溶液，做DPPH自由基的清除能力测定时再分别稀释至0.05、0.10、0.15、020、0.25mg/mL。用分析天平准确称量DPPH0.0597g，然后用无水乙醇溶解定容至250ml容量瓶中，即可得到浓度为6×10-4mol/L的DPPH溶液，备用，避光冷藏。

    按表1中加入溶液后充分摇匀，静置在黑暗处30min，用无水乙醇为空白，在波长517nm下测定溶液A0、Ai、Aj相对应的吸光度值，记录数据，根据清除率公式计算其清除率值[6]。

    （3）测定羟基自由基的清除能力。①最大吸收波长的确定：取10mL具塞比色管，逐一加入0.8mmol/L邻二氮菲溶液3mL，PBS缓冲溶液4mL，去离子水1mL，混合均匀，再滴加08mmol/L的硫酸亚铁溶液1mL，接着滴加95%的乙醇1mL，摇匀后放在37℃的水浴中温浴1h，空白对照为去离子水，在紫外-可见分光光度计上190nm～800nm进行波谱扫描，确定最大吸收波长为510nm[7]。②样品测定：取10mL具塞比色管，逐一加入0.8mmol/L邻二氮菲溶液3mL，PBS缓冲溶液4mL，去离子水1mL，混合均匀，再滴加0.8mmol/L的硫酸亚铁溶液1mL，即获得反应液;然后按表2加入不同溶液进行测定。

    分别取1mg/mL的样品（对照为Vc）溶液0.2、0.4、0.6、08、1.0mL放入带塞子的比色管中，然后对应加入0.8、0.6、04、0.2、0mL的去离子水，摇匀，逐一加入邻二氮菲溶液3mL，PBS缓冲溶液4mL，摇匀后加入硫酸亚铁溶液和H2O2溶液各1mL，于37℃的水浴锅中温热一小时，在波长为510nm处测定吸光度值，记为Aj。溶液羟基自由基清除率公式：

    （4）测定超氧阴离子自由基的清除作用。①最大吸收波长的确定：将3mL Tris-HCI缓冲溶液、4mL邻苯三酚溶液逐一加入10mL的比色管中，震荡摇匀，用蒸馏水定容至刻度。将蒸馏水作为空白对照，在紫外-可见分光光度计190nm～800nm范围内扫描，从而确定出最大吸收波长为320nm。②样品测定：分别取1mg/mL的样品溶液（对照为芦丁）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于10mL的比色管中，逐一加入Tris-HCl缓冲溶液3mL、邻苯三酚溶液4mL，让其充分反应5min后，用0.1mol/L的盐酸溶液终止反应，滴入蒸馏水补充至刻度，在320nm处测得吸光度值A0、Ai。另外取1mg/mL的样品溶液0.2、0.4、06、0.8、1.0mL，分别加入3mLTris-HCl缓冲溶液、0.1mL盐酸溶液于10mL比色管中，用蒸馏水定容至刻度，在波长320nm处测其吸光度值Aj。

    其中，A0为邻苯三酚自氧化的空白吸光度值;Ai为加入样品后邻苯三酚自氧化的吸光度值;Aj为样品和缓冲溶液的吸光度值，即样品样色对自氧化的干扰值[9]，作图分析清除率作用。

    2 结果与分析

    2.1 野生黑茶中各极性萃取物对DPPH的自由基的清除

    根据所得数据作图，如图1所示，各极性萃取物对DPPH的自由基清除率均随着样品浓度值增加而增大，对照品Vc的活性最高，石油醚相最低，当样品浓度增加到015—025mg/mL时，表现比较好的是乙酸乙酯相和正丁醇相，两者的清除率均高于对照品芦丁的清除率，并非常接近对照品Vc的清除率值，达到了93.63%。通过数据分析可知野生黑茶有较好的清除DPPH自由基的活性。

    2.2 野生黑茶中各极性萃取物对羟基自由基的清除

    通过作图分析可知（如图2），各极性部分的清除率基本随浓度的增加而递增，其中乙酸乙酯相递增最快，在0.4mg/mL时高于其他各相，随着浓度持续增加，各极性萃取物对羟自由基的清除能力继续增大，并逐渐趋于稳定，各相中以乙酸乙酯相的清除率为最好，和Vc的清除率值比较接近，达到77.85%。因此，野生黑茶对羟自由基有較好的清除活性。

    2.3 野生黑茶中各极性萃取物对超氧阴离子自由基的清除

    通过作图分析可知（如图3），样品对超氧阴离子自由基的清除率基本是随着各自浓度的增加而呈上升趋势。在0.4～0.8mg/mL时，正丁醇相显示出较好的抗氧化活性，其清除率高于对照品芦丁。在浓度为1mg/mL时，正丁醇相的清除效率最好，达到42.25%，但比对照品芦丁低，其次是乙酸乙酯相和石油醚相。可知野生黑茶对超氧阴离子自由基有较好的清除活性。

    3 结论

    本文主要对野生黑茶不同极性溶剂提取物的抗氧化活性进行测定，选取了DPPH自由、羟基自由基和超氧阴离子自由基进行清除率实验，用Vc和芦丁作为对照品。实验结果表明，野生黑茶各极性部分均有较好的抗氧化活性，其中对DPPH自由基的清除效果最好，乙酸乙酯相和正丁醇相的清除率接近于对照品Vc的清除率;对羟基自由基的清除则是乙酸乙酯相的效果最好，明显高于其他三相的清除率;而正丁醇相对超氧阴离子自由基的清除最好，与对照品芦丁比较接近。因此，通过对比数据可知，野生黑茶提取物的乙酸乙酯相、正丁醇相活性较好，这为野生黑茶的进一步开发利用提供了参考依据。

    参考文献：

    [1]金裕范，高雪岩，王文全，等.云南普洱茶抗氧化活性的比较研究[J].中国现代中药，2011，13（8）：17-19.

    [2]Lin Y S，Tsai Y J，Tsay J S，et al.Factors affecting the levels of tea polyphenols and caffeine in tea leaves[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2003，51（7）：1864-1873.

    [3]揭国良，何普明，丁仁凤.普洱茶抗氧化特性的初步研究[J].茶叶，2005，31（3）：162-165.

    [4]何英姿，逯钊琦，陈艳芳，等.六堡茶茶褐素的提取工艺及其抗氧化活性研究[J].安徽农业科学，2013，40（35）：17301-17303.

    [5]张文博.植物样品成分的体外抗氧化活性方法研究进展[J].广州化工，2011，39（24）：14-16.

    [6]聂少平，谢明勇，罗珍.用清除有机自由基DPPH法评价茶叶多糖的抗氧化活性[J].食品科学，2006，27（3）：34-36.

    [7]李慎新，曹新志.几种茶叶中抗氧化性物质的比较研究[J].四川理工学院学报：自然科学版，2009，22（4）：82-84.

    [8]杨少辉，宋英今，王洁华.雪莲果体外抗氧化和自由基清除能力[J].食品科学，2010，31（17）：166-169.

    [9]林祥潮，黄晓东.中药对超氧阴离子自由基清除率的测定[J].广州化学，2012，37（1）：32-36.