毛细管电泳法在酶抑制剂筛选中的应用
刘冬梅 师彦平 陈娟
摘 要 毛细管电泳法以其分离效率高、耗时短、样品用量少、灵敏度高以及易于实现自动化等诸多特点，在筛选酶抑制剂研究中有着不可替代的优势。本文综述了毛细管电泳法在酶抑制剂筛选中的应用。主要介绍了应用最广泛的离线分析（Off-line assay）和在线分析（In-line assay），即柱前酶反应（Pre-capillary enzyme reaction）和在柱酶分析（In-capillary enzyme reaction）。并对该领域的未来发展进行了展望。
关键词 毛细管电泳； 酶抑制剂； 柱前酶反应； 在柱酶反应； 综述
1 引 言
人类疾病的产生往往与体内各种酶的异常表达有关，如果酶的活性异常高于正常水平，则会引起机体功能紊乱，引发疾病的产生。如乙酰胆碱酯酶（AChE）过多，则会过度分解神经递质乙酰胆碱，从而引起阿尔茨海默症（老年痴呆症）和肌无力【1】； 酪氨酸酶（TRS）是黑色素合成的关键酶和限速酶，TRS活性过高则会引起黑色素沉积，引发皮肤色素性疾病【2】。通过抑制关键酶来干预治疗已经成为现代医学很有吸引力的战略，目前有相当一部分临床药物来自酶抑制剂【3】。
酶抑制剂筛选的传统途径有放射性同位素法、薄层色谱法、电化学法、分光光度法和高效液相色谱法等，这些方法虽然已经非常成熟，但是仍然存在一些不可避免的缺陷【4】。毛细管电泳法以其分离效率高、耗时短、样品用量少、易于实现自动化等诸多特点，特别是高效分离机制，在酶抑制剂筛选中显示出传统方法无法比拟的优势。而且，毛细管电泳法可以结合多种检测方法，如紫外、激光诱导荧光、质谱、电化学以及辐射检测【5】等进行目标物的分析，其中，紫外检测以其成本低、操作方便、环境友好等优势成为最广泛使用的检测方法。
毛细管电泳-紫外检测的灵敏度受到待分析物浓度的限制。通过增加检测光程或样品浓缩富集可提高检测灵敏度【6】，例如改变检测池的几何形状，包括泡形池、Z形池和多次反射池来增加检测光程，以及零电压效应、样品堆积、场放大堆积和场放大进样等浓缩富集技术提高检测的灵敏度。Iqbal等【7】在监测核苷酸焦磷酸酶和磷酸二酯酶的反应时，在内壁涂层为聚凝胺阳离子的毛细管内，将聚凝胺加到缓冲溶液中，利用产物与聚凝胺电迁移方向相反，使得产物堆积来提高检测灵敏度。也可以通过将样品溶解在水中，或者采用稀释的缓冲液使样品堆积【8】。
毛细管电泳法筛选酶抑制剂主要有4种形式：柱前酶反应（Pre-capillary enzyme reaction）、毛细管进样端反应（At-inlet reaction）、电泳中介微分析（EMMA）、层流剖面的横向扩散（TDLFP）技术， 其中，At-inlet、EMMA和TDLFP都属于在柱酶反应（In-capillary enzyme reaction）。下面将对这几种形式进行总结论述。
2 柱前酶反应
离线分析（Off-line assay）就是反应物首先在毛细管之外混合，加入底物、酶或辅酶引发反应，经特定时间的孵育之后采取适当的方法猝灭酶促反应，然后将样品注入毛细管电泳中进行分离检测，通过测定产物或是底物的峰面积变化来进行酶促反应动力学、抑制动力学的研究以及抑制剂的筛选【9，10】。在柱前酶反应中，毛细管电泳只作为分离系统使用。
辛志宏等【11】利用毛细管离线分析测定了血管紧张素转化酶抑制剂Captopril的活性，优化了反应、分离条件，可以准确、简便、快速的分析Captopril的抑制活性，并且为进一步筛选血管紧张素转化酶抑制剂提供了筛选模型。栗娜等【12】利用毛细管电泳法测定了鸡肝二氢叶酸还原酶的活力，测定已知抑制剂的半数抑制浓度，与文献数值相比较，证明该体系可用于二氢叶酸还原酶抑制剂的筛选。贾蕊等【13】使用柱前酶反应与EMMA进行了二氢叶酸还原酶抑制剂的筛选，比较两种反应模式所得实验结果，发现柱前反应模式检测灵敏度高，迁移时间和峰面积重现性好，并且易于控制。种蕾等【14】由可口革囊星虫粗提物中筛选出7种对神经氨酸酶有抑制活性的粗提物，实验中优化了反应和分离分析条件，建立的模型可用于复杂体系中抗流感病毒药物神经氨酸酶抑制剂的筛选。Iqbal等【15】使用离线毛细管电泳法筛选和鉴定了腺苷激酶的抑制剂和底物。实验中底物和产物可以高效分离，使用标准抑制剂进行实验，与标准放射方法相比，两者抑制动力学常数Ki相近，证明了建立的筛选模型的可靠性和准确性。Chen等【16】测定了20S蛋白酶对多肽底物MG132和MG115的实时水解，以及一系列化合物对其抑制效果。37 ℃下混合底物和酶溶液引发酶促反应，冰浴中浸没10 min猝灭反应，离心后将上清液注入毛细管内进行分离检测。李冰等【17】使用蛋白-脂质体复合物进行柱外筛选单胺氧化酶（MAO）抑制剂，通过加入含EDTA和Na2S2O5的HClO4溶液猝灭反应，与传统的MAO抑制剂筛选方法相比简单、快速、节省酶源、干扰因素少。Bryant等【18】使用此模式研究了乙酰辅酶A羧化酶，实验中将生物素羧化酶和羧基转移酶加入含有抑制剂的反应混合物中，反应一段时间将混合物注入毛细管中分离。该研究允许同时筛选生物素羧化酶和羧基转移酶的抑制剂。Iqbal等【19】使用柱前酶反应进行了碳酸酐酶的酶促反应动力学和抑制反应动力学研究。他们将碳酸酐酶和底物4-硝基苯基乙酸酯在37 ℃下孵育10 min，降温终止反应，随后将反应混合物注入毛细管内，施加电压进行产物4-硝基苯酚的分离检测。Malina等【20】也使用了柱前酶反应进行磷酸果糖激酶-1的酶促反应动力学和抑制反应动力学研究，使用毛细管电泳进行产物与底物的分离，减少了抑制剂对产物的干扰，从而减少了假阳性，所得半数抑制浓度与耦合分光光度法相符。
离线分析中酶促反应和毛细管电泳分离是两个独立的体系，因此其条件可以分别优化，不会对彼此产生干扰。但该方法存在局限性：第一，酶促反应很快，所以混合物在注入毛细管之前，必须通过加入试剂或者改变反应条件来猝灭反应； 第二，尽管毛细管分离检测只需要纳升级的样品量，但是引发反应仍需要大量反应物，造成试剂浪费。在柱酶反应模式的出现弥补了上述不足。
3 在柱酶反应
在柱酶反应，毛细管不仅可以用作分离通道，同时也可以用作反应容器，酶可以被固定，或以自由酶存在于溶液中。该模式具有以下优点：反应溶液体积只需纳升级【21】，与柱前反应相比减少了试剂用量，大大降低了分析成本； 集进样、混合、反应、分离和检测于一个封闭的毛细管内，提高了分析效率； 有利于实现酶分析的自动化和微型化【22】。在柱酶反应可以分为EMMA、At-inlet和TDLFP三类。
3.1 电泳中介微分析（EMMA）
为解决柱前酶反应中样品消耗量大、无法实现自动化等缺陷，Bao和Regnier【23】首次报导了在线电泳酶分析，该模式后来被命名为电泳中介微分析（EMMA）。EMMA是在电场作用下利用反应物在缓冲液中表观迁移速率的差异来实现反应物在柱内混合，从而引发酶促反应，随后反应物和产物在毛细管内被分离为独立的区带至检测器被检测。在该模式中，酶与试剂的混合是在电场作用下的混合，无额外稀释和区带展宽效应。根据电场下反应物在毛细管内进样和混合模式，EMMA可以分为两类，即连续模式和区带-区带模式。
3.1.1 连续模式
连续模式是毛细管内预先充满一种反应物，根据第二种反应物的注射方式可分为两类：带状注射法（图1A）和移动界面注射法。Bao和Regnier【23】发展了带状注射法，并以葡萄糖-6-磷酸脱氢酶为模型对其进行验证。毛细管内预先充满含有底物葡萄糖-6-磷酸和辅酶NADH的运行缓冲液，酶溶液独立存在于一个进样瓶中，以区带模式进样，反应物在电场作用下混合引发酶促反应，随后反应物和产物在毛细管内被分离为独立的区带至检测器被检测。Harmon等【24】发展了移动界面注射法，以亮氨酸氨肽酶为模型对其进行验证。毛细管内预先充满迁移速度小的酶溶液，迁移速度大的底物L-亮氨酸-4-硝基苯胺溶液保存于进样端的缓冲液储液瓶中连续进样。带状注射法中，第二种反应物一旦进样就不会再有新的反应物进入毛细管内，而移动界面注射法在整个运行过程中都有新的底物注入毛细管内，从而增加了底物与酶的接触时间，增加产物产量，提高检测灵敏度。
3.1.2 区带-区带模式 根据毛细管内孵育缓冲液和背景电解质溶液的异同，区带-区带模式可以分为两类，即经典区带-区带模式和部分填充模式。
经典区带-区带模式（图1B）中反应缓冲液和分离缓冲液为同一种缓冲液，预先在毛细管内充满缓冲液，然后按照表观迁移速度由小到大的顺序将反应物以区带模式注入毛细管内。施加较小的电压之后，表观迁移速度大的反应物在毛细管内流速快，与表观迁移速度小的反应物混合重叠，从而引发酶促反应。可以通过关闭电压来延长反应时间，从而增加产物量，提高检测灵敏度。经孵育之后，增加电压分离产物和残余反应物。
与连续模式相比，区带-区带模式只需要一小段的反应物，反应物用量少，反应成本低，因此区带-区带模式是EMMA中最常用的。然而，在经典区带-区带模式中，缓冲液既要有利于酶促反应进行，又要有利于产物和反应物的分离，因此仍存在一定的局限性。van Dyck等【25】在研究牛血清胺氧化酶时，发现酶在背景电解质溶液中不能稳定存在，因此提出了部分填充模式，即毛细管的一部分填充有利于酶促反应的孵育缓冲液，剩余部分填充背景电解质溶液来实现产物和反应物的分离。一般，为了防止背景电解质溶液对酶促反应体系产生干扰，则在反应物之前注入一小段孵育缓冲液将酶与背景电解质溶液隔开（图1C）。
EMMA在筛选中药提取物中酶抑制剂时具有很大优势。由于α-葡萄糖苷酶的酶促反应体系最适孵育缓冲液为磷酸缓冲液（pH 7.0），而有利于产物和反应物分离的最适分离缓冲液硼砂（pH 9.2）对酶有灭活作用，所以EMMA部分填充技术被应用于α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选【26】。尽管有报导称电场作用下混合两种以上的反应物优化过程繁琐而且不切实际【27】，但是，Zhang等【5】在对细胞色素P450进行动力学研究时成功地发展了在柱电泳混合3个反应物区带的方法。Zhao等【28】借鉴此方法由中药中筛选了芳香化酶抑制剂，毛细管内样品注射顺序为辅酶、孵育缓冲液、芳香化酶、抑制剂和底物混合液，施加电压混合反应物，通过产物的峰面积来确定酶活，以及筛选抑制剂。此外，在对甘油激酶进行动力学研究时，Nehmé等【29】在EMMA部分填充技术的基础上首次发展了在线混合至少4个反应物区带的方法，反应物的注射顺序为：孵育缓冲液、抑制剂、ATP、甘油激酶、甘油，这种方法避免了预先混合底物和抑制剂这一步骤，从而减小了工作量。
为了提高EMMA的分离速度和灵敏度，Sanders等【30】基于区带-区带模式提出了快速转换电压极性的电泳中介微分析，如图1D所示：顺序进样酶和底物，底物的表观迁移速度较大，因此两者混合； 然后反转电极，酶和底物与原来相比反向迁移，因此底物与酶分离； 反转电极，底物与酶再次混合。此模式中，由于两种反应物的表观迁移速度的不同，当交替施加正负电压时，反应物持续快速混合，进而增加产物产量。
图1 在线分离的模式，（A）EMMA连续模式； （B）经典区带-区带模式； （C）部分填充模式； （D）快速切换电极EMMA； （E）进样端轴向扩散模；（F）层流剖面的横向扩散【31】
4 结 论
毛细管电泳作为一种高效、快速的分离技术，近年来在酶促反应动力学和抑制动力学研究领域得到广泛应用并得以快速发展。离线分析中可以对酶促反应条件和分离条件分别进行优化，因此限制因素少。在线分析集进样、混合、反应、分离和检测于一体，简化了操作步骤，缩短了分析时间，与离线分析相比，不仅可以减少试剂消耗，而且可以实现酶反应和检测的自动化和微型化。毛细管电泳法尤其是在线分析的优势，使其广泛地应用于酶抑制剂的筛选中。综上，在线分析的各种模式都具有各自的优势，但仍存在一些不足：如电泳中介微分析中酶不能够被重复利用，与固定化酶微反应器相比也造成了试剂浪费； 但毛细管在线固定化酶微反应器又不能适用于反应缓冲液和分离缓冲液不同的酶促反应体系，而且各种固定方法也存在各自的缺陷； 层流剖面的横向扩散优化条件繁琐，而且不能消除由缓冲液造成的稀释效应。因此，今后的发展方向是：（1）在现有的技术基础上，寻找新的材料，设计新的酶固定方法，以此同时实现毛细管的再生利用，提高固定化酶的稳定性； （2）设计毛细管电泳筛选酶抑制剂新的在线模式，以弥补上述在线模式的不足之处。随着毛细管电泳技术的不断发展完善，该技术应用于酶抑制剂筛选的研究也会愈加成熟。
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2 柱前酶反应
离线分析（Off-line assay）就是反应物首先在毛细管之外混合，加入底物、酶或辅酶引发反应，经特定时间的孵育之后采取适当的方法猝灭酶促反应，然后将样品注入毛细管电泳中进行分离检测，通过测定产物或是底物的峰面积变化来进行酶促反应动力学、抑制动力学的研究以及抑制剂的筛选【9，10】。在柱前酶反应中，毛细管电泳只作为分离系统使用。
辛志宏等【11】利用毛细管离线分析测定了血管紧张素转化酶抑制剂Captopril的活性，优化了反应、分离条件，可以准确、简便、快速的分析Captopril的抑制活性，并且为进一步筛选血管紧张素转化酶抑制剂提供了筛选模型。栗娜等【12】利用毛细管电泳法测定了鸡肝二氢叶酸还原酶的活力，测定已知抑制剂的半数抑制浓度，与文献数值相比较，证明该体系可用于二氢叶酸还原酶抑制剂的筛选。贾蕊等【13】使用柱前酶反应与EMMA进行了二氢叶酸还原酶抑制剂的筛选，比较两种反应模式所得实验结果，发现柱前反应模式检测灵敏度高，迁移时间和峰面积重现性好，并且易于控制。种蕾等【14】由可口革囊星虫粗提物中筛选出7种对神经氨酸酶有抑制活性的粗提物，实验中优化了反应和分离分析条件，建立的模型可用于复杂体系中抗流感病毒药物神经氨酸酶抑制剂的筛选。Iqbal等【15】使用离线毛细管电泳法筛选和鉴定了腺苷激酶的抑制剂和底物。实验中底物和产物可以高效分离，使用标准抑制剂进行实验，与标准放射方法相比，两者抑制动力学常数Ki相近，证明了建立的筛选模型的可靠性和准确性。Chen等【16】测定了20S蛋白酶对多肽底物MG132和MG115的实时水解，以及一系列化合物对其抑制效果。37 ℃下混合底物和酶溶液引发酶促反应，冰浴中浸没10 min猝灭反应，离心后将上清液注入毛细管内进行分离检测。李冰等【17】使用蛋白-脂质体复合物进行柱外筛选单胺氧化酶（MAO）抑制剂，通过加入含EDTA和Na2S2O5的HClO4溶液猝灭反应，与传统的MAO抑制剂筛选方法相比简单、快速、节省酶源、干扰因素少。Bryant等【18】使用此模式研究了乙酰辅酶A羧化酶，实验中将生物素羧化酶和羧基转移酶加入含有抑制剂的反应混合物中，反应一段时间将混合物注入毛细管中分离。该研究允许同时筛选生物素羧化酶和羧基转移酶的抑制剂。Iqbal等【19】使用柱前酶反应进行了碳酸酐酶的酶促反应动力学和抑制反应动力学研究。他们将碳酸酐酶和底物4-硝基苯基乙酸酯在37 ℃下孵育10 min，降温终止反应，随后将反应混合物注入毛细管内，施加电压进行产物4-硝基苯酚的分离检测。Malina等【20】也使用了柱前酶反应进行磷酸果糖激酶-1的酶促反应动力学和抑制反应动力学研究，使用毛细管电泳进行产物与底物的分离，减少了抑制剂对产物的干扰，从而减少了假阳性，所得半数抑制浓度与耦合分光光度法相符。
离线分析中酶促反应和毛细管电泳分离是两个独立的体系，因此其条件可以分别优化，不会对彼此产生干扰。但该方法存在局限性：第一，酶促反应很快，所以混合物在注入毛细管之前，必须通过加入试剂或者改变反应条件来猝灭反应； 第二，尽管毛细管分离检测只需要纳升级的样品量，但是引发反应仍需要大量反应物，造成试剂浪费。在柱酶反应模式的出现弥补了上述不足。
3 在柱酶反应
在柱酶反应，毛细管不仅可以用作分离通道，同时也可以用作反应容器，酶可以被固定，或以自由酶存在于溶液中。该模式具有以下优点：反应溶液体积只需纳升级【21】，与柱前反应相比减少了试剂用量，大大降低了分析成本； 集进样、混合、反应、分离和检测于一个封闭的毛细管内，提高了分析效率； 有利于实现酶分析的自动化和微型化【22】。在柱酶反应可以分为EMMA、At-inlet和TDLFP三类。
3.1 电泳中介微分析（EMMA）
为解决柱前酶反应中样品消耗量大、无法实现自动化等缺陷，Bao和Regnier【23】首次报导了在线电泳酶分析，该模式后来被命名为电泳中介微分析（EMMA）。EMMA是在电场作用下利用反应物在缓冲液中表观迁移速率的差异来实现反应物在柱内混合，从而引发酶促反应，随后反应物和产物在毛细管内被分离为独立的区带至检测器被检测。在该模式中，酶与试剂的混合是在电场作用下的混合，无额外稀释和区带展宽效应。根据电场下反应物在毛细管内进样和混合模式，EMMA可以分为两类，即连续模式和区带-区带模式。
3.1.1 连续模式
连续模式是毛细管内预先充满一种反应物，根据第二种反应物的注射方式可分为两类：带状注射法（图1A）和移动界面注射法。Bao和Regnier【23】发展了带状注射法，并以葡萄糖-6-磷酸脱氢酶为模型对其进行验证。毛细管内预先充满含有底物葡萄糖-6-磷酸和辅酶NADH的运行缓冲液，酶溶液独立存在于一个进样瓶中，以区带模式进样，反应物在电场作用下混合引发酶促反应，随后反应物和产物在毛细管内被分离为独立的区带至检测器被检测。Harmon等【24】发展了移动界面注射法，以亮氨酸氨肽酶为模型对其进行验证。毛细管内预先充满迁移速度小的酶溶液，迁移速度大的底物L-亮氨酸-4-硝基苯胺溶液保存于进样端的缓冲液储液瓶中连续进样。带状注射法中，第二种反应物一旦进样就不会再有新的反应物进入毛细管内，而移动界面注射法在整个运行过程中都有新的底物注入毛细管内，从而增加了底物与酶的接触时间，增加产物产量，提高检测灵敏度。
3.1.2 区带-区带模式 根据毛细管内孵育缓冲液和背景电解质溶液的异同，区带-区带模式可以分为两类，即经典区带-区带模式和部分填充模式。
经典区带-区带模式（图1B）中反应缓冲液和分离缓冲液为同一种缓冲液，预先在毛细管内充满缓冲液，然后按照表观迁移速度由小到大的顺序将反应物以区带模式注入毛细管内。施加较小的电压之后，表观迁移速度大的反应物在毛细管内流速快，与表观迁移速度小的反应物混合重叠，从而引发酶促反应。可以通过关闭电压来延长反应时间，从而增加产物量，提高检测灵敏度。经孵育之后，增加电压分离产物和残余反应物。
与连续模式相比，区带-区带模式只需要一小段的反应物，反应物用量少，反应成本低，因此区带-区带模式是EMMA中最常用的。然而，在经典区带-区带模式中，缓冲液既要有利于酶促反应进行，又要有利于产物和反应物的分离，因此仍存在一定的局限性。van Dyck等【25】在研究牛血清胺氧化酶时，发现酶在背景电解质溶液中不能稳定存在，因此提出了部分填充模式，即毛细管的一部分填充有利于酶促反应的孵育缓冲液，剩余部分填充背景电解质溶液来实现产物和反应物的分离。一般，为了防止背景电解质溶液对酶促反应体系产生干扰，则在反应物之前注入一小段孵育缓冲液将酶与背景电解质溶液隔开（图1C）。
EMMA在筛选中药提取物中酶抑制剂时具有很大优势。由于α-葡萄糖苷酶的酶促反应体系最适孵育缓冲液为磷酸缓冲液（pH 7.0），而有利于产物和反应物分离的最适分离缓冲液硼砂（pH 9.2）对酶有灭活作用，所以EMMA部分填充技术被应用于α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选【26】。尽管有报导称电场作用下混合两种以上的反应物优化过程繁琐而且不切实际【27】，但是，Zhang等【5】在对细胞色素P450进行动力学研究时成功地发展了在柱电泳混合3个反应物区带的方法。Zhao等【28】借鉴此方法由中药中筛选了芳香化酶抑制剂，毛细管内样品注射顺序为辅酶、孵育缓冲液、芳香化酶、抑制剂和底物混合液，施加电压混合反应物，通过产物的峰面积来确定酶活，以及筛选抑制剂。此外，在对甘油激酶进行动力学研究时，Nehmé等【29】在EMMA部分填充技术的基础上首次发展了在线混合至少4个反应物区带的方法，反应物的注射顺序为：孵育缓冲液、抑制剂、ATP、甘油激酶、甘油，这种方法避免了预先混合底物和抑制剂这一步骤，从而减小了工作量。
为了提高EMMA的分离速度和灵敏度，Sanders等【30】基于区带-区带模式提出了快速转换电压极性的电泳中介微分析，如图1D所示：顺序进样酶和底物，底物的表观迁移速度较大，因此两者混合； 然后反转电极，酶和底物与原来相比反向迁移，因此底物与酶分离； 反转电极，底物与酶再次混合。此模式中，由于两种反应物的表观迁移速度的不同，当交替施加正负电压时，反应物持续快速混合，进而增加产物产量。
图1 在线分离的模式，（A）EMMA连续模式； （B）经典区带-区带模式； （C）部分填充模式； （D）快速切换电极EMMA； （E）进样端轴向扩散模；（F）层流剖面的横向扩散【31】
4 结 论
毛细管电泳作为一种高效、快速的分离技术，近年来在酶促反应动力学和抑制动力学研究领域得到广泛应用并得以快速发展。离线分析中可以对酶促反应条件和分离条件分别进行优化，因此限制因素少。在线分析集进样、混合、反应、分离和检测于一体，简化了操作步骤，缩短了分析时间，与离线分析相比，不仅可以减少试剂消耗，而且可以实现酶反应和检测的自动化和微型化。毛细管电泳法尤其是在线分析的优势，使其广泛地应用于酶抑制剂的筛选中。综上，在线分析的各种模式都具有各自的优势，但仍存在一些不足：如电泳中介微分析中酶不能够被重复利用，与固定化酶微反应器相比也造成了试剂浪费； 但毛细管在线固定化酶微反应器又不能适用于反应缓冲液和分离缓冲液不同的酶促反应体系，而且各种固定方法也存在各自的缺陷； 层流剖面的横向扩散优化条件繁琐，而且不能消除由缓冲液造成的稀释效应。因此，今后的发展方向是：（1）在现有的技术基础上，寻找新的材料，设计新的酶固定方法，以此同时实现毛细管的再生利用，提高固定化酶的稳定性； （2）设计毛细管电泳筛选酶抑制剂新的在线模式，以弥补上述在线模式的不足之处。随着毛细管电泳技术的不断发展完善，该技术应用于酶抑制剂筛选的研究也会愈加成熟。
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