禾本科植物离体再生体系研究进展
张 童
摘要：阐述了几种禾本科植物离体再生体系研究现状。着重介绍了外植体选择、褐化现象及其防治措施以及离体再生体系建立的主要步骤，最后对离体再生培养技术做了展望。
关键词：外植体；离体再生；愈伤组织；褐化现象
0 前言。在20世纪60年代和70年代，随着植物细胞和组织培养方法的增多，人们已开始将其应用于研究许多重要的作物。在早期的工作中，由于使用相对成熟而复杂的外植体，因此限制了植株的形态发生和表达。组织培养植株再生中器官发生包括由茎尖、腋芽、原球茎、球茎、块萃、鳞茎等外植体直接分化成器官的直接发生和外植体先脱分化形成愈伤组织再分化成器官的间接器官发生，笔者主要是做前者。白茅为禾本科白茅属多年生草本，根可吃，也可入药，根状茎十分发达，在生长地块上纵横交错，可防风固堤，能在其它植物难以生长的纯沙地上生长。白茅根的化学成分以三萜类化合物为主：芦竹素(Amndoin)、白茅素(Cylindrin)、羊齿烯(Ferrleno1)、乔木萜烷(Arborane)、异乔木萜烷(Isoarborino1)、西米杜鹃醇(Simiareno1)、乔木萜醇(Arborino1)、乔木萜醇甲醚(Arborinol methyl ether)、乔木萜酮(Arborinone)和木栓酮(Filedelin)等。其茎含有果糖、甘露醇、柠檬酸等成分。白茅根实际为白茅的根状茎。其性寒、味甘，能清热凉血、利尿通淋，关于白茅根的降温作用早在清代已有记载。如张锡钝在《医学衷中参西录》中这样说"茅根禀少阳最初之气，凉而能散。其凉散之力，能将脏腑经络间之毒热尽数排出" 且把单味鲜白茅根列为治疗温热病的重要方剂[1]。近年来，在白茅根的化学成分、药理作用、临床应用与炮制等研究方面已取得了一定进展，但还存在一些问题，目前对其药理作用研究还停留在表面，在炮制工艺方面缺乏行之有效的标准规范化操作方法，今后需利用现代科学技术与方法对白茅根化学成分进行系统研究探索。其主要化学成分与生理活性的关系，同时进一步完善白茅根质量标准研究内容，建立一种国内外均可接受的完整的质量控制系，为其走向国际市场
奠定坚实的技术基础利用植物脱毒、离体快繁、人工种子等技术可以解决一些植物种质退化、珍稀名贵植物快速繁殖等问题。随着人们对离体条件下诱导植物外植体再生植株的机理及影响因素、外植体褐变及其抑制等研究的不断深入，植株再生体系的建立已经取得了快速发展。
1 外植体选择
对于离体再生体系的建立，选择合适的外植体尤为重要。植物细胞具有全能性, 任何组织、细胞、器官都能再生植株, 但事实上, 不同品种、器官之间分化能力差异很大, 外植体的制备和培养又是建立在无菌操作基础上的一门技术, 选择适宜的外植体是确保外植体培养成功的一个重要因素, 把好材料的灭菌关是提高接种成功率的关键。对于不同的实验目的选择外植体的方法也不一样，下面介绍几种禾本科外植体的不同选择方法及要求。
据了解，在小麦遗传转化中,幼胚是应用最早的外植体。许多研究认为,幼胚愈伤组织的诱导和植株再生能力高于幼穗和成熟胚,目前获得成功转化的转基因植株大多数来自于幼胚或幼胚愈伤组织。然而,陈梁鸿等,林刚、李根英、赵林姝等在比较幼穗和幼胚为受体的转化研究后认为,幼穗的转化效果优于幼胚,幼穗较幼胚更耐继代,更易形成再生植株。而对于麻竹的离体快速繁殖而言，选取枝条刚停止生长，枝稍展叶3～7片，基部枝箕枯黄或者开始剥落，末萌侧芽或刚萌侧芽作为外植体为佳。在水稻不同外植体的组织培养研究中，研究最多的为花药、幼穗、幼胚、成熟胚(种子)4种外植体。玉米的外植体最常选用幼胚、幼叶、幼雌（雄）穗、下胚轴和成熟胚。白茅主要是茎生长点和根状茎的节，最好的外植体材料是地上部与地下部交接处，因为此处芽点最多，利于诱导出更多丛生芽。
植物组织培养要能在各个方面得到有效的应用，首先取决于实验材料培养效果的优劣，而影响培养效果的主要因素是基因型和外植体种类。
2 离体再生系统的建立
广义的植物组织培养不仅包括在无菌条件下利用人工培养基对植物组织的培养，而且包括对原生质体、悬浮细胞和植物器官的培养。因为培养的器官已经脱离了母体，所以也称之为离体培养。植物组织培养研究自德国植物生理学G．Haberlandt的工作开始，及1934年美国学者White等用番茄根进行组织培养，首次建立了活跃生长的无性繁殖系以来，至今已有100多年的历史。现在植物组织培养技术已在科研和生产中广泛应用，成为最常用的生物工程技术之一。植物组织培养可以进行植物离体快繁、无病毒苗木培育、培育新品种或创制新物种、次生代谢产物的生产、植物种质资源的离体保存、人工种子等方面的应用。其中离体快繁是组织培养在林木生产上应用最广泛、最成功的一个领域。离体再生体系建立关键是外植体的选择、培养基和无菌体系的建立，前文笔者已将外植体的选择做了介绍，这里不再赘述，不同植物所需要的生长条件不同,所用的培养基也有所不同。较常用的基础培养基有MT、MS、SH、N6 、White 等。
无菌体系的建立主要有外植体的脱毒、所需培养基和操作工具的高压灭菌、 超净工作台。外植体脱毒通常是通过茎尖处理、茎尖结合热处理、冷处理、化学药剂处理及愈伤组织处理等方法可以去除植物病毒[2]。培养基用常压或高压蒸煮等湿热灭菌、器械采用灼烧灭菌、玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌、不耐热的物质采用过滤灭菌、植物材料表面用消毒剂灭菌、物体表面用药剂喷雾灭菌、接种室等空间采用紫外线或熏蒸灭菌。
3 影响愈伤组织形成的激素
植物组织培养是在无菌条件下,将离体的植物器官(根尖、茎尖等)、组织(形成层、花药组织等)、细胞(体细胞、生殖细胞等)、胚胎(成熟或未成熟的胚)、原生质体等在人工配制的培养基上培养,给予适宜的培养条件,诱发其产生愈伤组织或潜伏芽或长成完整的植株的技术[3]，其原理是细胞全能性。在组织培养中,愈伤组织和胚状体能否形成是培育出新植株的关键。通过在基础培养基里添加一定浓度的外源激素,可诱导出愈伤组织、胚状体、不定芽、根等器官,最终获得再生植株或次生物质。最常用的诱导愈伤组织的生长素是IAA、NAA和2 ,4 - D ,所需浓度为0. 01～10 mg/ L 。最常用的细胞分裂素是KT和ABA ,使用浓度为0. 1～10mg/ L 。KT的主要作用是促进细胞分裂和愈伤组织分化。ABA对植物体细胞胚的发生与发育具有重要作用。各类植物激素的生理作用虽有相对专一性,但是植物的各种生理效应是不同种类激素之间相互作用的综合表现。
4 植物组织培养中的褐化现象及其防止措施
4.1 褐化现象的原因及其特性
褐化是植物组织培养中较为常见的一种现象，也称为褐变，在植物组织培养、细胞悬浮培养和原生质体培养中常有发生。褐变现象原因主要有非酶促褐变和酶促褐变。非酶促褐变是由于细胞受胁迫或其他不利条件影响所造成的细胞程序化死亡或自然发生的细胞死亡，即坏死形成的褐变现象，并不涉及酚类物质的产生。在外植体再生分化过程中会有很多因素造成的细胞程序化死亡或自然发生的细胞死亡，但这种褐变若采取适当措施或者愈伤组织适应了胁迫环境就不再发生。多数认为，植物组织培养中的褐化现象主要是由酶促褐变引起的，即由多酚氧化酶(PPO，Poly-phenol Oxidase)作用于天然底物酚类物质而引起的。一般认为，褐化是指外植体或培养材料接种后在组织培养过程中，由于切割造成机械损伤，伤口处分泌出酚类化合物，在有氧条件下，切面细胞中的酚类物质为多酚氧化酶催化，氧化为醌，醌再通过非酶促反应产生有色物质而导致组织褐变，变成棕褐色或暗褐色，并逐渐扩散到培养基中，抑制细胞内其它酶的活性，影响细胞的正常代谢，毒害整个组织，导致组织死亡。
4.2 褐化现象的防治措施
褐化现象的防治措施主要是根据导致褐化的原因来解决。最直接的防治措施就是在培养基中添加防褐剂，选用适宜的抗氧化剂与吸收剂种类及含量。其它防治措施还有改变培养基的状态、选择适宜的接种方式、通过试验选择适宜的消毒方式等。
5 小结
21世纪是生物技术迅速发展的世纪，而植物组织培养技术是生物技术中的重要内容，可以用于植物育种、脱毒和离体快繁、种质资源的保存及其交换，在遗传、生化、生理、病理等研究上均有应用。组织培养是生物工程的基础和关键环节之一，并且在农业生产实际应用中越来越广泛，发挥的作用越来越大。据了解，现在市场对组培苗的需求量逐步递增，这为植物组织培养离体快繁技术提供了广阔的前景。当然，现在的离体再生培养技术与理论还有待更好的完善，如污染、褐化现象等问题的有效防治措施，随着科技的进步，这项技术会发挥巨大的作用。
参考文献
[1]薛永锋，田桢.白茅根治疗癌症晚期发热109例分析，张家口医学院分报，2001．
[2]符国芳.李青.植物组织培养脱毒方法综述.福建林业科技.2007，34（3）．
[3]王文静,袁道强,高松洁.植物组织培养的应用现状[J].河南师范大学报.2000.（3）：137-139．
