基于半仿生酶解技术的中药乌贼墨最佳用酶初步筛选

    陶然 刘金虎 毛会秀 吕迎兰 王娅玲 李佳怿 王舒玉 王集会 张珊珊

    

    

    摘 ?????要：以体外抗肿瘤实验为指标，初步确定中药乌贼墨的最佳用酶。用人胃肠道系统中的胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，胃蛋白酶，弹性蛋白酶酶解乌贼墨，以乌贼墨水提液为对照组，在茚三酮显色法测定水解度的基础上，采用四唑盐（MTT）比色法研究四种蛋白酶酶解液对肺腺癌细胞株A549的抑制作用，初步筛选出最佳用酶。四种蛋白酶酶解中药乌贼墨后的蛋白质水解度分别为胰蛋白酶5.12%，胃蛋白酶4.61%，胰凝乳蛋白酶2.09%，弹性蛋白酶0.32%。抗肿瘤实验结果表明：胰蛋白酶酶解液在药物浓度0.4～1.4 mg·mL-1范围内，细胞抑制率均在85%～95%。其他三种酶解液的抑制率在各实验浓度范围内均未超过30%。通过半仿生酶解技术，初步筛选出酶解中药乌贼墨的最佳用酶为胰蛋白酶。

    关 ?键 ?词：中药乌贼墨;水解度;抑制率;最佳用酶

    中图分类号：R282.77 ??????文献标识码： A ??????文章编号： 1671-0460（2019）04-0738-04

    Abstract： ?In order to determine the optimum enzyme of Chinese traditional medicine cuttlefish ink by anti-tumor experiment in vitro， the squid ink was hydrolyzed by trypsin， chymotrypsin， pepsin and elastase in human gastrointestinal system. And then using the squid ink extract as control group， the hydrolysis degree was determined by ninhydrin chromogenic method. The inhibitory effects of four protease hydrolysates on lung adenocarcinoma cell line A549 were studied by tetrazolium （MTT） colorimetry. The results showed that the degrees of protein hydrolysis of Chinese squid ink by enzymatic hydrolysis of trypsin， pepsin， chymotrypsin and elastase were 5.12%， 4.61%， 2.09% and 0.32%. The results of antitumor experiment showed that the inhibition rate of trypsin enzymatic hydrolysis solution in the range of 0.4～1.4 mg·mL-1 was in the range of 85%～95%，while the inhibition rates of the other three kinds of enzymatic hydrolysates were not more than 30% in each range of experimental concentration. So the trypsin was screened out as the best enzyme for enzymatic hydrolysis of squid ink.

    Key words： Chinese medicine squid ink; Degree of hydrolysis; Inhibition rate; Optimum enzyme

    烏贼（Sepia），本名乌鲗，又称花枝、墨斗鱼或墨鱼，属于软体动物门头足纲乌贼目乌贼科的一种海洋动物[1]。乌贼种类繁多，分布于中国福建南部、广东，日本海域。乌贼墨作为一种中药，文献上早有记载，《本草拾遗》中有：“腹中墨，主治血刺心痛”。在《本经》中有记载：“可收敛止血，固精止带，制酸定痛，除湿敛疮”。现代临床证明它是一种良好的止血用药，且无明显副作用[2]。近代研究表明乌贼墨还具有抗肿瘤，抗氧化，抗辐射，抗菌，促造血及调血脂功能等作用[3]。

    海洋动物药是中医药的重要组成部分，其用于防治疾病已有几千年的历史。海洋药物通常具有多咸、多寒的药性特点，其成分除了常见的萜类、生物碱、甾醇之外，还有一些特殊结构的成分，如多卤素取代结构，多氧、氮结构[4]。

    中药经口服进入人体后，其消化和吸收除了pH的调节外，还有多种酶在起着催化作用。半仿生-酶法就是模拟胃肠道的环境和运行原理，用适当的酶对药物进行酶解，得到含指标成分较高的“活性混合物”的一种新型提取方法，为中药及其复方研究提供新思路[5]。

    为了筛选出酶解中药乌贼墨的最佳用酶，本文应用半仿生技术，模拟胃肠道的环境和运行原理，用胃中的胃蛋白酶，胰脏中的弹性蛋白酶，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶酶解乌贼墨，并以乌贼墨水提液为对照组，运用半微量凯氏定氮法和茚三酮显色法测定蛋白酶酶解液中蛋白质的水解度;将酶解液制成冻干粉，用其配制成一系列不同浓度的药液，运用MTT比色法测定药物对肺腺癌细胞株A549的抑制率，优选出酶解乌贼墨的最佳用酶[6]。为今后乌贼墨的活性组分和生产工艺研究及临床应用提供参考。

    1 ?实验部分

    1.1 ?试药及细胞

    乌贼墨粉（购自安徽省亳州市的中国（亳州）中药材交易中心，经山东中医药大学药学院高德民副教授鉴定为乌贼科动物无针乌贼和金乌贼等乌贼墨囊中的墨汁）。

    肺腺癌A549细胞株由山东省立医院提供。

    2 ?實验方法

    2.1 ?半微量凯氏定氮法测定乌贼墨粉总氮量

    称取0.08 g乌贼墨粉于干燥的50 mL凯氏烧瓶中，依次加入0.30 g硫酸钾、5滴30%硫酸铜溶液、2.0 mL硫酸;用小火缓缓加热，气泡消失后，逐步加大火力，待溶液变成澄明的绿色，继续加热10 min，停止加热，放置冷却，加入2 mL水。取40 mL 2%硼酸溶液于100 mL锥形瓶中，加5滴甲基红-溴甲酚绿混合指示液，将冷凝管尖端插人液面下。将凯氏烧瓶中内容物转入蒸馏瓶中，加入10 mL 40%氢氧化钠溶液，进行蒸气蒸馏，至硼酸液变为蓝绿色后，继续蒸馏约10 min，将冷凝管尖端提出液面使蒸气继续冲洗1 min后停止蒸馏。馏出液用硫酸滴定液滴定至溶液由蓝绿色变为灰紫色[7]。做空白对照，平行三次实验。根据每1 mL硫酸滴定液（0.005 mol·L-1）相当于0.140 1 mg的N，计算出1 g乌贼墨粉中的总氮量。

    2.2 ?乌贼墨酶解液的制备

    精密称取乌贼墨粉1.000 0 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，加入40 mL蒸馏水，调节pH值为8，超声提取30 min，37 ℃加热4 h，在转速4 000 r/min、温度4 ℃条件下，离心15 min，抽滤，定容至100 mL容量瓶中，制得乌贼墨水提液。按表3制备四种蛋白酶酶解液。每组进行三次平行试验。

    2.3 ??乌贼墨酶解液含量测定

    2.3.1 ?甘氨酸标准曲线的绘制

    精密称取干燥至恒重的甘氨酸0.100 0 g，配制成1 mg·mL-1的甘氨酸溶液，取2.00 mL定容至100 mL容量瓶，取1、2、3、4、5 mL标准溶液定容至10 mL容量瓶，配成浓度为2、4、6、8、10 ?g·mL-1甘氨酸的稀释液，取2 mL各稀释液于具塞试管中，同时做空白对照，加入1.00 mL茚三酮显色剂，充分混匀，放置100 ℃水浴锅中加热15 min，冷水冷却置室温，加入5 mL 40%乙醇溶液混匀，静置15 min后，在570 nm波长下测定吸光度，并绘制标准曲线。

    2.3.2 ?乌贼墨酶解液含量的测定

    取“2.2”项制备的蛋白酶酶解液适量，稀释到适宜浓度，按“2.3.1”项茚三酮显色法测定蛋白酶酶解液的吸光度。将吸光度带入甘氨酸的标准曲线，算出蛋白酶酶解液中甘氨酸的含量，从而计算得到氨基态氮的含量，根据水解度和1 g乌贼墨粉总氮量计算四种蛋白酶酶解液中蛋白质的水解度。

    式中：A—乌贼墨粉总氮数;

    B—乌贼墨蛋白酶酶解液中游离的氨基态氮数;

    C—乌贼墨水提液中游离的氨基态氮数。

    2.4 ?MTT法测定乌贼墨冻干粉对肺腺癌细胞株A549的抑制作用

    2.4.1 ?乌贼墨药物的配制

    按“2.1”项制得乌贼墨的水提液和蛋白酶酶解液，冻干后精密称取冻干粉10 mg，用二甲基亚砜（DMSO）溶解，加入RPMI-1640培养基至药物浓度为2 mg·mL-1，然后在无菌环境中用0.22 μm的滤膜过滤，用已滤菌的1640培养基依次稀释，配成 1.4、1.2、1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 mg·mL-1的药物浓度梯度。

    2.4.2 ?细胞铺板和加药

    取对数增长期的人肺癌A549细胞，经胰酶消化后，用计数板细胞计数，以100 μL·孔-1接种于96孔平底培养板中，空出板的边缘孔，板的上方预留调零孔，调零孔只加不含血清的1640培养基，不加细胞。置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的CO2培养箱中无菌培养24 h;至细胞生长旺盛贴壁后，去掉培养基，加药孔每孔加入100 μL药液，每个药物浓度重复4次，空白孔加入100 μL RPMI-1640培养液，阳性对照为100 μL 100 μg·mL-1的顺铂，继续培养24 h。

    2.4.3 ??MTT比色法测定细胞抑制率

    吸去上清液，在避光条件下，每个孔加入20 μL，5 mg·mL-1的MTT溶液，在37 ℃条件下孵育4 h，然后吸尽上清液，每孔加入100 μL二甲基亚砜，轻轻拍打板壁，至沉淀完全溶液后，用酶标仪在波长492 nm下测定OD值，进而计算细胞抑制率[8]。

    3 ?实验结果

    3.1 ?甘氨酸标准曲线

    采用茚三酮显色法，在波长为570 nm下测定甘氨酸的吸光度，以甘氨酸的浓度（μg·mL-1）为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程：

    3.2 ?乌贼墨酶解液的含量测定

    根据半微量凯氏定氮法测得1 g乌贼墨粉的总氮量为57.09 mg。根据表4可知，胰蛋白酶对乌贼墨的酶解效果最佳，其氨基态氮含量为5.162 7 mg·g-1，DH为5.12%，其次是胃蛋白酶，氨基态氮含量为4.879 5 mg·g-1，DH为4.61%，胰凝乳蛋白酶氨基态氮含量为3.503 6 mg·g-1，DH为2.09%，弹性蛋白酶对乌贼墨的酶解效果最差，氨基态氮含量为2.3584 mg·g-1，水解度仅为0.32%。

    3.3 ?MTT法测定乌贼墨酶解产物对肺腺癌细胞株A549的抑制作用

    通过测定细胞抑制率可以反映药物对细胞增殖的影响。图1为5种条件下的酶解液对肺腺癌细胞株A549的抑制率，由图可知，胰蛋白酶酶解液对肺腺癌细胞A549的抑制效果最为显著，药物浓度在0.4 mg·mL-1时，细胞抑制率就有了大幅度的提升。随着药物浓度的升高，均有显著的抑制作用。弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶酶解液及无酶的乌贼墨水提液对肺腺癌细胞A549的抑制作用微小，其细胞抑制率均为超过30%。

    4 ?结 论

    乌贼墨的主要化学成分是黑色素和蛋白多糖复合体。20世纪90年代，日本弘前大学医学部和青森县产业技术开发中心用大白鼠所做的動物实验表明，乌贼墨含有抗癌物质，据分析这是一种蛋白质，脂肪等与糖结合的复合多糖，从而使得乌贼墨抗肿瘤的研究成为新的热点[9]。近年来的研究证实，乌贼墨中的黑色素、肽聚糖、寡肽均有抗肿瘤作用。乌贼墨的抗肿瘤活性主要通过免疫系统作用而产生，包括影响免疫细胞活性，影响细胞内蛋白激酶活性等[10]。半仿生–酶法模拟胃肠环境，使温度更加接近人的体温，克服了高温提取导致有效成分被破坏等问题。在中药提取加入适当的酶以破环物质结构，可以促进中药中有效成分的溶出[5]。

    通过本实验结果显示，四种酶对中药乌贼墨均有一定的酶解作用，其水解度大小依次为胰蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶;但经四种蛋白酶酶解后的乌贼墨酶解液的蛋白质水解度均未超过10%。利用MTT法对其抗肿瘤效果进行了研究发现，四种蛋白酶酶解液对肺腺癌细胞A549的抑制率大小依次为胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、胃蛋白酶;其中胰蛋白酶酶解液的抗肿瘤作用最为显著，在药物浓度为0.4 mg·mL-1时，抑制作用大幅度提升，随着药物浓度的增加，均有较好的抑制作用。分别用胃蛋白酶，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶酶解后的产物对肺腺癌细胞株A549的抑制作用较差，细胞抑制率在10%～30%之间波动。乌贼墨经胃蛋白酶酶解后的水解度与经胰蛋白酶酶解后的相近，但在药理活性上却有着很大的差异，在药物浓度0.2～1.4 mg·mL-1范围内，胃蛋白酶酶解液对细胞的抑制率均未超过50%，对肺腺癌细胞株A549抑制作用极低。胃蛋白酶的抗肿瘤作用最差，可能是因为经胃蛋白酶酶解后黑色素等具有抗肿瘤作用的活性物质沉淀而被过滤掉。在实验过程中，胃蛋白酶酶解后的粗解液经离心抽滤后得到的酶解液接近透明，无色。而胰蛋白酶的酶解液粘稠，颜色墨黑。其原因是胃蛋白酶的酶解pH为2，胰蛋白酶的酶解pH为8，而乌贼墨中的黑色素可溶于碱性溶液，在酸性环境下会产生沉淀[11]。通过实验研究，推测乌贼粉中抗肿瘤物质可能是经胰蛋白酶酶解后产生的小分子肽等具有抗肿瘤的活性物质。胰蛋白酶酶解后的乌贼墨酶解液具有较好的水解度和体外抗肿瘤活性，初步筛选为中药乌贼墨的最佳用酶。

    参考文献：

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    [9]Takaya Y. Uchisawa H，Matsue H，et al.An investigation of the antitumor peptidoglycan fraction from squid ink[J]. ?Biological and Pharmaceutical Bulletin，1994，17（6）：846-849.

    [10]黄芳芳. 乌贼墨寡肽酶解工艺及抗前列腺癌机制研究[D]. 浙江海洋学院，2011.

    [11]马维娜. 杨吉贤.乌贼墨的研究[J]. 长春中医学院学报，1996，12（57）：52.