银杏叶黄酮化合物提取和纯化研究进展
李琦
摘 ?????要：系统归纳总结了银杏叶黄酮化合物提取和纯化方法，从提取率、提取纯度、工业化适用性和环保性等角度，详细分析了溶剂提取法、酶辅助提取法、微波提取法、超声波提取法和超临界CO2萃取提取法的优缺点;并根据银杏叶黄酮化合物的结构差异性，对其纯化方法-膜分离、大孔树脂和聚酰胺分离等研究现状系统地总结对比;最后，对银杏叶黄酮化合物的提取开发技术提出建议和展望。
关 ?键 ?词：银杏叶;黄酮;提取;纯化;研究进展
中图分类号：S713; ?R284.2 ??????文献标识码： A ??????文章编号： 1671-0460（2019）04-0812-04
Abstract： Extraction and purification methods of flavonoids from Ginkgo biloba leaves were introduced， including organic solvent method， enzyme-assisted method， microwave-assisted method， ultrasonic method， supercritical CO2 extraction method and so on. Their advantages and disadvantages were discussed from the aspects of extraction yield， extraction purity， industrial applicability and environmental protection effect. Furthermore， the research progress of membrane separation， microporous resin and polyamide resin purification methods were systematically reviewed. In the end， the development trend of extraction and purification technologies of Ginkgo biloba leaf flavonoids was prospected.
Key words： Ginkgo biloba leaves; Flavonoids; Extraction; Purification; Research progress
我國植物资源丰富，对天然植物的根茎叶进行提取纯化可得到具有多种生物活性的化合物，对我国食品、医药和保健品等行业的发展具有重要意义。银杏叶提取物的主要活性成分为银杏叶黄酮，具有清除自由基、抗氧化和改善心脑血管循环等多种功能，可以起到预防和治疗心脑血管等疾病的作用。由于来源于天然产物，且具有优异生物活性，而被广泛应用于化妆品、保健品和医药等多种领域。银杏叶黄酮的提取与功能应用研究一直是天然产物研究的热点之一[1]，已有多篇论文对银杏叶提取物研究现状进行综述报道，如徐芳[1]、陈西娟[2]等[3]对银杏叶黄酮的化学结构、药理临床应用、提取工艺等研究进展进行阐述，但对银杏叶黄酮的纯化精制、性能和构效关系等概括还不够系统。
本文则系统地对银杏叶黄酮提取方法优缺点进行概括比较，分析银杏叶黄酮膜分离、树脂法、柱层析分离纯化技术研究现状，并对银杏叶黄酮提取纯化技术发展进行展望。
1 ?银杏叶黄酮的提取方法
根据提取过程采用的供能方式（如微波和超声波）、体系（如溶剂和超临界流体）以及其它辅助物质等，银杏叶黄酮化合物提取方法主要有溶剂浸提法、酶辅助法、微波法、超声波法和超临界流体法等。
1.1 ?溶剂浸提法
溶剂浸提法是目前应用最广泛的银杏叶黄酮提取方法[4]。文献报道中所浸提用溶剂多采用极性较大的乙醇水体系，例如，薛志彬[5]利用70%乙醇作为浸提所用的溶剂，在80 ℃下，提取3.0 h，总黄酮纯度达16.13%。贾长英[6]等研究发现乙醇溶剂浸提条件的影响规律如下：乙醇体积分数>料液比>浸提时间>浸提温度。乙醇水体系作为溶剂，相比其它大极性溶剂如丙酮等，毒性小，残留处理方便;溶剂提取法方便、操作简易，然而存在提取率低、操作时间长、材料浪费等弊端。
1.2 ?酶辅助提取法
由于植物中的活性成分多存在于根茎叶中，而根茎叶中主要结构组织成分为三大素-纤维素、半纤维素和木质素，均为聚合的高分子化合物，且具有稳定密集的结晶区，三大素的紧密结构导致植物中活性成分更难被提取，采用温和的生物酶技术破坏三大素结构来提高活性成分的提取效果是近年来植物提取发展的新技术[7]。银杏叶黄酮多存在于银杏叶细胞内，银杏叶细胞壁主要成分是纤维素，利用纤维素酶破坏细胞壁结构，可使细胞内的黄酮更多地溶解于溶剂中[8]。因此，生物酶技术也逐步被用于银杏叶黄酮的提纯技术中，在提纯过程中，利用纤维素酶先降解细胞壁中纤维素，释放出细胞壁中黄酮，可大幅度增大银杏叶黄酮的提取率，而且，提纯结束可通过瞬间升温等方式，将生物酶杀死，不会在目标产物中残留含有毒副作用的物质。吴梅林[9]等利用纤维素酶辅助法提取银杏叶总黄酮，与乙醇浸提提取法相比，总黄酮得率提高了18.92%;CHEN Shuo [10]利用纤维素酶法提取银杏叶黄酮，同时加入麦芽糖作为糖基，促进黄酮苷配基的转糖基作用，使苷元转变为极性更大的苷，从而使更多的有效成分溶解于提取液中，比在相同条件而无酶时产率提高了102%。酶辅助法可大幅度提高提取率，而且环保、安全性好等，所得提取物可用于食品和营养品添加应用。
1.3 ?微波辅助提取法
微波辅助提取技术具有副产物少，速度快和产率高等优点，已经被广泛应用于黄酮的提取[11，12]。徐春明[13]等利用微波辅助乙醇溶剂法提取银杏叶总黄酮，得出较佳的提取条件，在温度70 ℃，料液比为1∶25，乙醇体积分数70%，微波功率300 W，微波时间60 s的条件下提取银杏叶，总黄酮的提取率可达到2.698%。但微波温度过高会破坏黄酮类物质结构，且更容易溶解出更多的杂质，且当功率较大温度较高时，溶剂很易挥发，造成一定污染。因此，微波提取法在提取功率和温度上有待进一步优化，如控低温而保持微波功率的作用。
1.4 ?超声波辅助提取法
豁银强[14]利用超声波技术提取银杏叶黄酮，在70%乙醇作为浸提液，超声功率100 W条件下，将超声辅助乙醇浸提，在提取时间50 min，液料比为30∶1时，得到银杏叶黄酮的提取率为3.51%。GAO Han [15]则先进行21.66 min超声，再经39.34 ℃下2 h的提取，产品黄酮纯度为40.62mg/g。超声波辅助溶剂提取法，不需高温条件，控制简便[16]，但易形成超声空白区，且设备制造成本较高。
超声波和微波均是利用介观尺度的能量波为能源，快速提取植物有效物的一种方法，其穿透度对植物提取作用影响较大。黄莉莉[17]探索了微波和超声辅助提取银杏叶有效成分过程中尺度的影响，通过理论分析微波和超声波穿透深度的大小，确定两种方法作用的尺度范围，通过比较微波功率密度、辐射时间和料液比3个因素，发现在50 ℃以下，超声波法提取率均明显高于微波辅助提取法。
1.5 ?超临界CO2提取法
何扩[18]利用超临界CO2提取法，提取率为3.27%，纯度为64.7%;韩玉谦[19]等用超临界CO2提取法，同样条件下，采用乙醇提取法所得银杏叶黄酮的提取率仅为2.56%，质量分数为27.1%，而超临界CO2法得到的黄酮提取率提高到3.95%，黄酮质量分数提高到35.28%。采用超临界CO2提取银杏黄酮，可大幅度提高提取效率 [20]，但由于工业化萃取设备的费用较大，仍不适宜用于大规模提纯银杏叶黄酮。
另外，在银杏叶黄酮提取过程中，还可添加其它化学物质以增加收率等。例如，在体系中添加表面活性剂还可提高活性物质的溶解度和溶出速度，提高活性物质的收率，但所加化学助剂的残留会对银杏叶黄酮目标活性产物造成污染，并未被广泛采用。
2 ?銀杏叶黄酮的纯化方法
采用前面所述提取方法所得到的银杏叶提取物中黄酮含量偏低，达不到相应行业标准，特别是药用标准，还需要进行进一步精制纯化，提高黄酮纯度。纯化银杏黄酮最常用的方法是膜分离法、大孔树脂和聚酰胺树脂层析法。
2.1 ?膜分离法
膜分离是纯化技术中较成熟稳定的方法，也被用于纯化银杏叶黄酮研究中。XU Zhihong[21]采用自制的PVDF-PVP膜对银杏叶提取物进行精致提纯，最终将黄酮纯度从21.3%提高至34.8%，由于膜的制备采用氧化法，体系pH和压力均对提取效果具有一定影响，pH的增加会导致提纯效果变差。ZHU Minghang[22]采用超滤膜法纯化银杏叶黄酮，发现超滤膜MWCO（10 000 Dalton）效果最佳，可将银杏黄酮纯度从质量分数24%提高到68%，温度是影响提纯效果的最大因素。贠延滨[23]则采用三步骤的膜分离技术进行超滤提纯银杏叶黄酮粗提物，将黄酮的纯度由24%提升到99.2%。膜分离能耗低，设备易放大;具有工艺简单、节能、成本低的优点，且所得产品纯度高，便于工业放大。
2.2 ?大孔树脂法
由于大孔树脂具有物化稳定高、吸附容量大、选择性好、易再生等特点，利用大孔树脂对银杏叶提取物进一步纯化的研究越来越受到关注。根据黄酮苷以及黄酮苷元的极性不同，采用不同浓度的乙醇-水溶液，利用大孔树脂纯化黄酮极为广泛。吴梅林[24]用AB-8大孔吸附树脂在pH =5、流速为1.0 mL/min、70%乙醇为洗脱剂纯化银杏叶总黄酮，纯度提高至26%;吴昊[25]用S-8大孔树脂，对粗黄酮粉纯化，黄酮的纯度达48.03%。倪力军[26]研究发现银杏叶中黄酮的含量对采用大孔树脂纯化银杏叶具有重要影响，选用黄酮含量分别为1.0%、0.8%和0.6%的三批银杏叶，研究发现0.6%黄酮含量的工艺参数最为敏感，提取物中黄酮含量与乙醇浓度和洗脱液体积成正相关，提取物得率与洗脱液体积负相关，并得到较佳的纯化银杏叶黄酮的工艺，在保持原料银杏叶中的黄酮含量为1%左右时，以2倍质量15%乙醇进行洗脱，可获得符合中国药典要求的银杏叶提取物。孙胜武[27] 建立了基于黄酮类银杏叶提取物的特征图谱和总黄酮醇苷含量的综合评分法，用于评价银杏叶提取物的质量，使用AB-8大孔树脂纯化银杏叶提取物，在体系pH=5.0，先后采用25%和75%乙醇洗脱，为银杏叶提取物质量的评价方式提供新思路。
2.3 ?聚酰胺树脂层析法
王永刚[28]利用70%乙醇洗脱，经聚酰胺树脂纯化洗脱后，黄酮纯度可达到63.8%。ZHANG Jing[29]利用聚酰胺树脂纯化法，采用30%乙醇洗脱，黄酮纯度提高可至55%。相比大孔树脂，聚酰胺树脂对银杏叶黄酮的纯化，具有更强的选择性，具有更好的分离纯化效果，但聚酰胺树脂作为吸附剂，洗脱速度迟缓，且小分子量的聚酰胺容易霉变混入产品中，导致产品质量不稳定或下降。
此外，硅胶柱色谱、离子交换树脂、离子液体/盐双水相体系和金属络合-解离法等也常用来作为银杏黄酮的纯化精制。
3 ?展 望
我国植物资源丰富，发展植物提取技术，对增加我国资源高效利用具有重要意义。全球对银杏叶提取物的需求量日益增多，对银杏叶黄酮的提取纯度也有更高的要求，目前银杏叶黄酮的提取和纯化技术繁多[30，31]，基本能满足医药食品等工业需求。此外，银杏叶黄酮清除自由基的能力与其作为活泼氢供体的酚羟基有着密切联系，银杏叶黄酮的酚羟基基团具有很强的还原能力，容易被氧化，在提取纯化和放置过程中均有一定不稳定性[32，33]，在以后的研究中可考虑采用适当技术，如减少提取物与空气氧气接触机会或加抗氧化剂，消除结构不稳定性的影响。银杏叶提取物在医药行业中的应用不仅要求银杏叶黄酮含量达到一定值，还对其它副产物具有严格要求，如具有毒副作用的银杏酸含量要低，对银杏叶提取物的精密分离和分析技术同样值得进一步研究[34];随着多学科技术交叉协作发展，银杏叶黄酮的提取和纯化技术将逐渐提高和完善。
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