采油污水对斑马鱼SOD活性的影响
刘超群+吴杨+张薇+徐长君+宝力德
摘要：超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）是生物防御系统中重要的一种酶。通过研究采油污水对生物体内SOD活性的影响，可以判断采油污水对生物体产生的毒害以及对环境产生的污染。本实验采用斑马鱼为实验材料，通过比色法和酶液提取技术，以不同浓度的采油污水胁迫培养斑马鱼，然后测定斑马鱼的头部、肌肉和内脏中SOD活性。实验结果显示，在采油污水胁迫培养的斑马鱼体内的sOD活性的变化与污水的浓度也就是污染物胁迫强度有着一定的关系。其中以斑马鱼头部的SOD活性变化最为显著，在无采油污水胁迫的对照组中斑马鱼头部的SOD活性为16.73U/mg，而在采油污水稀释浓度为0.03的全致死组中培养的斑马鱼头部的SOD活性为239.09U/mg。说明在没有采油污水污染的情况下斑马鱼的SOD基础活性比较低，在全致死浓度时其活性在斑马鱼头部中上升了14倍左右，变化非常明显。因此可以通过检测斑马鱼头部的SOD活性的变化去判断斑马鱼是否受到水中污染物的毒害，进而判断环境污染的程度。为环境检测提供实验依据，为采油污水的综合化处理和环境污染的治理提供简便的检测手段。另外本研究发现在大庆地区采油污水中斑马鱼全致死浓度为该污水的33倍稀释浓度，反映出目前大庆地区的水源被采油污水污染较严重。采油污水的排放质量不达标，急需加强对采油污水的排放进行治理，改善大庆地区水源环境质量。
关键词：采油污水；斑马鱼；SOD；环境污染
中图分类号：X502 文献标识码：A 文章编号：2095—672Xf2016）06—0072—05
DOI：10.16647/j.cnki.cn15-1369/X.2016.06.016
引言
现今，随着人类对石油资源的不断开采，产生了大量的采油污水，并对环境造成了严重的污染。大庆作为我国重要的石油基地，同样面临着此种情况。为了保证石油的产量，新采油技术不断的开发，我国的石油污染状况和性质也发生了巨变。采油污水主要来自于石油生产过程中注采不平衡时所产生的污水，以及油气集输装置检修和冲洗管线时所产生的污水，该污水成分较复杂，其中的污染成分来源于采油生产的各个生产工序。采油污水中主要成分是：原油、地层中的盐类、气体、悬浮物、化学药剂、微生物等。采油污水是否会对环境产生污染、对生态产生破坏，引起人们的广泛关注。
斑马鱼（Danio rerio）是一种体型较小生活在热带的鱼类。其身体近似纺锤形，成年斑马鱼体长约5cm，身体两侧有银色斑纹，身体背部呈橄榄色，在身体的其他部位还有与其相同的斑纹。斑马鱼还具有繁殖快、数量多、便于获取培养、易成活等优点。水生生态环境的污染对斑马鱼产生的影响较明显，故本实验选用斑马鱼作为检测采油污水对水质污染程度的生物检测的实验鱼。
超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）是生物防御系统中重要的一种酶，广泛存在于动、植物的细胞中，其功能主要是清除细胞中的超氧阴离子游离基，将其转化为H2O2和O2，再经过氧化氢酶的作用转化成水和氧气。通常情况下在动、植物体中处于动态平衡。超氧化物歧化酶不仅可清除、阻止因氧游离基对动、植物细胞造成的损害，还能够及时修复被损害的细胞，并复原游离基对细胞造成的伤害。
当生物体受到环境胁迫时，表现出SOD活性的变化，测定SOD活性的变化能推断出生物体受到环境胁迫的程度。本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性的大小。在有氧化物质的存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2，从而抑制甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。在采油污水中胁迫培养的斑马鱼的SOD活性的变化，反应出了采油污水对水生生物的毒害，进而推断出采油污水对水生生态环境的污染程度。
1材料与方法
1.1实验材料
实验材料为斑马鱼，购于大庆市让胡路区博奥国际花鸟鱼市场。在整个实验过程中规定实验用斑马鱼必须年龄相同、品种相同、大小相同、生理状况相同，实验用斑马鱼必须颜色纯正、活动自如、无任何外伤、各项生理状况等完全正常，任何有异常的鱼都不可以作为实验鱼。
1.2采油污水的稀释
采油污水取于油田水处理联合站。
取实验室专用清洁纱布，对采油污水进行过滤，去除其它物质，将最后得到的采油污水浓度规定为单位1，向其中加去离子水稀释，得到浓度分别为0.01，0.04，0.07，0.10，0.13，0.16六组浓度，并对每组污水设置一组平行实验组。
1.2.1试剂的配制
（1）磷酸缓冲液（浓度为0.05 mol/L，pH值为7.8）：取浓度为0.1 mol/L，pH值为7.8的Na3P04缓冲液50mL，将其定容至100mL容量瓶中，充分混匀。并置于4℃冰箱中避光保存，以备后用。
（2）EDTA—核黄素混合液：取浓度为0.1mmol/L的EDTA试剂50mL将其与浓度为2mmol/L的核黄素试剂50mL混合，移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。置于4℃冰箱中避光保存备用。
（3）Met溶液：取0.3879g的Met粉末，用PBS缓冲液溶解并定容至100mL。
（4）NBT溶液：取0.1533g的NBT粉末，用100mL蒸馏水溶解并定容250mL。
（5）石英砂
1.3确定斑马鱼的致死、半致死浓度
用1000mL烧杯分别装上述浓度的采油污水，每烧杯中培养8條斑马鱼。再取1000mL烧杯装相同体积的去离子水分别培养8条斑马鱼，作为对照。把实验组和对照组烧杯中的水温调至最适温度值，从实验用斑马鱼中随机抽取出斑马鱼，将其立刻投入烧杯中，每烧杯投入8条斑马鱼。设定一个实验周期为96h，分别在在24h、48h、72h、96h的时间点观察并记录斑马鱼的存活数量，并计算出死亡率，最后根据此数据得出斑马鱼的致死浓度和半致死浓度的大致范围。斑马鱼是否死亡可根据是否有活动迹象，比如是否呼吸、触碰其身体后是否游动等，从而判断斑马鱼是否存活。
根据致死浓度和半致死浓度范围在将此浓度范围分成六个浓度梯度，进一步缩小浓度范围。最终确定斑马鱼的全致死浓度、半致死浓度和1/4致死浓度。
1.4酶液的粗提取
从实验烧杯中取出斑马鱼，在预冷的条件下，将斑马鱼的头部、肌肉和内脏分别称取0.4 g置于研钵中，加入预冷的2mL浓度为0.05mol/L的pH值为7.8的磷酸缓冲液，将其置于冰浴中研磨粉碎后，将其移入容量为10mL的离心管中，然后再用6mL浓度为0.05mol/L的pH值为7.8的磷酸缓冲液对其进行冲洗，并一同倒入同一离心管中。将离心管置于离心机中于10000rpm下离心15min。然后将离心管中的上清液取出，移入10mL容量瓶中定容，然后将其置于4℃下保存，用于测定超氧化物歧化酶的活性。
1.5 SOD活性单位的测定
在560nm波长下，测定不同酶液量的吸光值。通过计算得出抑制NBT光还原的相对百分率。以酶液用量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，绘制出二者相关曲线。从而得出抑制NBT光还原相对百分率为50%时的超氧化物歧化酶的酶液量（μL），并以此规定为一个酶活力单位（U）。
1.6 NBT法测定SOD活性
将待测组设置成1/4致死浓度（稀释浓度为0.015）、半致死浓度（稀释浓度为0.019）和全致死浓度（稀释浓度为0.03）。并用去离子水做两组相同对照。取0.3mL蛋氨酸+0.3mL EDTA—核黄素混合溶液+0.3mL NBT+1.5mL磷酸缓冲液（0.05mol/L，pH值为7.8）+0.1mL酶液，混匀。将对照组中的一组试管外侧套上略长于试管的避光锡纸。另一对照组置于正常实验条件下曝光。待其静止大约25分钟之后，置于560nm下，测定其OD值。重复进行此实验三次，实验结果取平均值。
2结果与讨论
2.1采油污水中斑马鱼致死浓度的确定
经测定，斑马鱼的全致死浓度为0.03、半致死浓度为0.019、1/4致死浓度为0.015。
2.2 SOD活性
通过NBT法测定了在不同的采油污水浓度中培养的斑马鱼不同组织提取液中的SOD的酶活性，得出以下数据：
在图1中分析了斑马鱼体内各部位的SOD活性受不同浓度的采油污水胁迫的变化趋势。
如表1和图1所示，在相同的处理时间和环境条件下，随着采油污水浓度的增加，斑马鱼体内的SOD活性随之增大。以斑马鱼头部为例：对照组SOD活性为16.73U/mg、1/4致死组SOD活性为75.95U/mg、半致死组SOD活性为128.23U/mg、全致死组SOD活性为239.09U/mg。
实验结果显示，采油污水对斑马鱼头部的SOD活性影响最明显，而内脏中的SOD活性次之，肌肉中的SOD活性最小。这种结果可能是由于鳃是斑马鱼的呼吸器官，通过吸取水中的氧气进行呼吸，直接与体外环境进行物质交换，且斑马鱼头部组织的细胞较易受到污染物的损伤，导致SOD活性增加。而斑马鱼内脏中的心脏与肝脏作为斑马鱼生存的主要代谢中心和解毒中心。心脏的功能是推动血液流动，向组织和器官输送足够的血液，以供应氧和营养物质，并带走代谢的终产物（如二氧化碳、尿素和尿酸等），使细胞维持正常的代谢和功能。而肝脏对来自体内和体外的非营养物质如各种药物、毒物以及体内某些代谢产物，具有生物转化作用。通过新陈代谢将它们彻底分解或以原形排出体外，从而起到解毒作用。在本实验中表现为在采油污水浓度较低时，斑马鱼内脏中的SOD活性变化较大。而随着采油污水浓度的增加，进入内脏中的大量污染物会反过来抑制斑马鱼内脏的代谢活动，导致斑马鱼内脏中的SOD活性的变化比在低浓度采油污水胁迫培养的斑马鱼内脏中的SOD活性的变化小。采油污水中的大量污染物主要通过斑马鱼内脏的代谢活动进入到斑马鱼的肌肉组织，所以，采油污水浓度的增加对肌肉中SOD活性的变化最小，且斑马鱼肌肉中的SOD活性的变化趋势与内脏中SOD活性的变化趋势类似，都是在采油污水浓度较小时，SOD活性变化较大，而随着采油污水浓度的增加，SOD活性变化较小。
采油污水的污染造成了斑马鱼体内各种细胞的损伤，并产生了更多的超氧阴离子游离基，机体为了消除这些超氧阴离子游离基，产生了SOD活性升高的现象。
3结论
研究发现，随着采油污水的浓度不断增加，斑马鱼体内的SOD活性增大。本实验通过对不同浓度采油污水胁迫培养后的斑马鱼体内的SOD活性进行分析，可知在无采油污水胁迫的对照组中斑马鱼头部的SOD活性为16.73U/mg，而在采油污水稀释浓度为0.03的全致死组中培养的斑马鱼头部的SOD活性为239.09U/mg。说明在没有采油污水污染的情况下斑马鱼的SOD的基础活性比较低，在全致死浓度时其活性在斑马鱼头部中上升了14倍左右，变化非常明显。因此可以通過检测斑马鱼头部的SOD活性的变化去判断斑马鱼是否受到水中污染物的毒害，进而判断环境污染的程度，为环境检测提供实验依据，为采油污水的综合化处理和环境污染的治理提供简便的检测手段。另外本研究发现在大庆地区采油污水中斑马鱼全致死浓度为该污水的33倍稀释浓度，反映出目前大庆地区的水源被采油污水污染较严重，采油污水的排放质量不达标，急需加强对采油污水的排放进行治理，改善大庆地区水源环境质量。
摘要：超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）是生物防御系统中重要的一种酶。通过研究采油污水对生物体内SOD活性的影响，可以判断采油污水对生物体产生的毒害以及对环境产生的污染。本实验采用斑马鱼为实验材料，通过比色法和酶液提取技术，以不同浓度的采油污水胁迫培养斑马鱼，然后测定斑马鱼的头部、肌肉和内脏中SOD活性。实验结果显示，在采油污水胁迫培养的斑马鱼体内的sOD活性的变化与污水的浓度也就是污染物胁迫强度有着一定的关系。其中以斑马鱼头部的SOD活性变化最为显著，在无采油污水胁迫的对照组中斑马鱼头部的SOD活性为16.73U/mg，而在采油污水稀释浓度为0.03的全致死组中培养的斑马鱼头部的SOD活性为239.09U/mg。说明在没有采油污水污染的情况下斑马鱼的SOD基础活性比较低，在全致死浓度时其活性在斑马鱼头部中上升了14倍左右，变化非常明显。因此可以通过检测斑马鱼头部的SOD活性的变化去判断斑马鱼是否受到水中污染物的毒害，进而判断环境污染的程度。为环境检测提供实验依据，为采油污水的综合化处理和环境污染的治理提供简便的检测手段。另外本研究发现在大庆地区采油污水中斑马鱼全致死浓度为该污水的33倍稀释浓度，反映出目前大庆地区的水源被采油污水污染较严重。采油污水的排放质量不达标，急需加强对采油污水的排放进行治理，改善大庆地区水源环境质量。
关键词：采油污水；斑马鱼；SOD；环境污染
中图分类号：X502 文献标识码：A 文章编号：2095—672Xf2016）06—0072—05
DOI：10.16647/j.cnki.cn15-1369/X.2016.06.016
引言
现今，随着人类对石油资源的不断开采，产生了大量的采油污水，并对环境造成了严重的污染。大庆作为我国重要的石油基地，同样面临着此种情况。为了保证石油的产量，新采油技术不断的开发，我国的石油污染状况和性质也发生了巨变。采油污水主要来自于石油生产过程中注采不平衡时所产生的污水，以及油气集输装置检修和冲洗管线时所产生的污水，该污水成分较复杂，其中的污染成分来源于采油生产的各个生产工序。采油污水中主要成分是：原油、地层中的盐类、气体、悬浮物、化学药剂、微生物等。采油污水是否会对环境产生污染、对生态产生破坏，引起人们的广泛关注。
斑马鱼（Danio rerio）是一种体型较小生活在热带的鱼类。其身体近似纺锤形，成年斑马鱼体长约5cm，身体两侧有银色斑纹，身体背部呈橄榄色，在身体的其他部位还有与其相同的斑纹。斑马鱼还具有繁殖快、数量多、便于获取培养、易成活等优点。水生生态环境的污染对斑马鱼产生的影响较明显，故本实验选用斑马鱼作为检测采油污水对水质污染程度的生物检测的实验鱼。
超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）是生物防御系统中重要的一种酶，广泛存在于动、植物的细胞中，其功能主要是清除细胞中的超氧阴离子游离基，将其转化为H2O2和O2，再经过氧化氢酶的作用转化成水和氧气。通常情况下在动、植物体中处于动态平衡。超氧化物歧化酶不仅可清除、阻止因氧游离基对动、植物细胞造成的损害，还能够及时修复被损害的细胞，并复原游离基对细胞造成的伤害。
当生物体受到环境胁迫时，表现出SOD活性的变化，测定SOD活性的变化能推断出生物体受到环境胁迫的程度。本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性的大小。在有氧化物质的存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2，从而抑制甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。在采油污水中胁迫培养的斑马鱼的SOD活性的变化，反应出了采油污水对水生生物的毒害，进而推断出采油污水对水生生态环境的污染程度。
1材料与方法
1.1实验材料
实验材料为斑马鱼，购于大庆市让胡路区博奥国际花鸟鱼市场。在整个实验过程中规定实验用斑马鱼必须年龄相同、品种相同、大小相同、生理状况相同，实验用斑马鱼必须颜色纯正、活动自如、无任何外伤、各项生理状况等完全正常，任何有异常的鱼都不可以作为实验鱼。
1.2采油污水的稀释
采油污水取于油田水处理联合站。
取实验室专用清洁纱布，对采油污水进行过滤，去除其它物质，将最后得到的采油污水浓度规定为单位1，向其中加去离子水稀释，得到浓度分别为0.01，0.04，0.07，0.10，0.13，0.16六组浓度，并对每组污水设置一组平行实验组。
1.2.1试剂的配制
（1）磷酸缓冲液（浓度为0.05 mol/L，pH值为7.8）：取浓度为0.1 mol/L，pH值为7.8的Na3P04缓冲液50mL，将其定容至100mL容量瓶中，充分混匀。并置于4℃冰箱中避光保存，以备后用。
（2）EDTA—核黄素混合液：取浓度为0.1mmol/L的EDTA试剂50mL将其与浓度为2mmol/L的核黄素试剂50mL混合，移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。置于4℃冰箱中避光保存备用。
（3）Met溶液：取0.3879g的Met粉末，用PBS缓冲液溶解并定容至100mL。
（4）NBT溶液：取0.1533g的NBT粉末，用100mL蒸馏水溶解并定容250mL。
（5）石英砂
1.3确定斑马鱼的致死、半致死浓度
用1000mL烧杯分别装上述浓度的采油污水，每烧杯中培养8條斑马鱼。再取1000mL烧杯装相同体积的去离子水分别培养8条斑马鱼，作为对照。把实验组和对照组烧杯中的水温调至最适温度值，从实验用斑马鱼中随机抽取出斑马鱼，将其立刻投入烧杯中，每烧杯投入8条斑马鱼。设定一个实验周期为96h，分别在在24h、48h、72h、96h的时间点观察并记录斑马鱼的存活数量，并计算出死亡率，最后根据此数据得出斑马鱼的致死浓度和半致死浓度的大致范围。斑马鱼是否死亡可根据是否有活动迹象，比如是否呼吸、触碰其身体后是否游动等，从而判断斑马鱼是否存活。
根据致死浓度和半致死浓度范围在将此浓度范围分成六个浓度梯度，进一步缩小浓度范围。最终确定斑马鱼的全致死浓度、半致死浓度和1/4致死浓度。
1.4酶液的粗提取
从实验烧杯中取出斑马鱼，在预冷的条件下，将斑马鱼的头部、肌肉和内脏分别称取0.4 g置于研钵中，加入预冷的2mL浓度为0.05mol/L的pH值为7.8的磷酸缓冲液，将其置于冰浴中研磨粉碎后，将其移入容量为10mL的离心管中，然后再用6mL浓度为0.05mol/L的pH值为7.8的磷酸缓冲液对其进行冲洗，并一同倒入同一离心管中。将离心管置于离心机中于10000rpm下离心15min。然后将离心管中的上清液取出，移入10mL容量瓶中定容，然后将其置于4℃下保存，用于测定超氧化物歧化酶的活性。
1.5 SOD活性单位的测定
在560nm波长下，测定不同酶液量的吸光值。通过计算得出抑制NBT光还原的相对百分率。以酶液用量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，绘制出二者相关曲线。从而得出抑制NBT光还原相对百分率为50%时的超氧化物歧化酶的酶液量（μL），并以此规定为一个酶活力单位（U）。
1.6 NBT法测定SOD活性
将待测组设置成1/4致死浓度（稀释浓度为0.015）、半致死浓度（稀释浓度为0.019）和全致死浓度（稀释浓度为0.03）。并用去离子水做两组相同对照。取0.3mL蛋氨酸+0.3mL EDTA—核黄素混合溶液+0.3mL NBT+1.5mL磷酸缓冲液（0.05mol/L，pH值为7.8）+0.1mL酶液，混匀。将对照组中的一组试管外侧套上略长于试管的避光锡纸。另一对照组置于正常实验条件下曝光。待其静止大约25分钟之后，置于560nm下，测定其OD值。重复进行此实验三次，实验结果取平均值。
2结果与讨论
2.1采油污水中斑马鱼致死浓度的确定
经测定，斑马鱼的全致死浓度为0.03、半致死浓度为0.019、1/4致死浓度为0.015。
2.2 SOD活性
通过NBT法测定了在不同的采油污水浓度中培养的斑马鱼不同组织提取液中的SOD的酶活性，得出以下数据：
在图1中分析了斑马鱼体内各部位的SOD活性受不同浓度的采油污水胁迫的变化趋势。
如表1和图1所示，在相同的处理时间和环境条件下，随着采油污水浓度的增加，斑马鱼体内的SOD活性随之增大。以斑马鱼头部为例：对照组SOD活性为16.73U/mg、1/4致死组SOD活性为75.95U/mg、半致死组SOD活性为128.23U/mg、全致死组SOD活性为239.09U/mg。
实验结果显示，采油污水对斑马鱼头部的SOD活性影响最明显，而内脏中的SOD活性次之，肌肉中的SOD活性最小。这种结果可能是由于鳃是斑马鱼的呼吸器官，通过吸取水中的氧气进行呼吸，直接与体外环境进行物质交换，且斑马鱼头部组织的细胞较易受到污染物的损伤，导致SOD活性增加。而斑马鱼内脏中的心脏与肝脏作为斑马鱼生存的主要代谢中心和解毒中心。心脏的功能是推动血液流动，向组织和器官输送足够的血液，以供应氧和营养物质，并带走代谢的终产物（如二氧化碳、尿素和尿酸等），使细胞维持正常的代谢和功能。而肝脏对来自体内和体外的非营养物质如各种药物、毒物以及体内某些代谢产物，具有生物转化作用。通过新陈代谢将它们彻底分解或以原形排出体外，从而起到解毒作用。在本实验中表现为在采油污水浓度较低时，斑马鱼内脏中的SOD活性变化较大。而随着采油污水浓度的增加，进入内脏中的大量污染物会反过来抑制斑马鱼内脏的代谢活动，导致斑马鱼内脏中的SOD活性的变化比在低浓度采油污水胁迫培养的斑马鱼内脏中的SOD活性的变化小。采油污水中的大量污染物主要通过斑马鱼内脏的代谢活动进入到斑马鱼的肌肉组织，所以，采油污水浓度的增加对肌肉中SOD活性的变化最小，且斑马鱼肌肉中的SOD活性的变化趋势与内脏中SOD活性的变化趋势类似，都是在采油污水浓度较小时，SOD活性变化较大，而随着采油污水浓度的增加，SOD活性变化较小。
采油污水的污染造成了斑马鱼体内各种细胞的损伤，并产生了更多的超氧阴离子游离基，机体为了消除这些超氧阴离子游离基，产生了SOD活性升高的现象。
3结论
研究发现，随着采油污水的浓度不断增加，斑马鱼体内的SOD活性增大。本实验通过对不同浓度采油污水胁迫培养后的斑马鱼体内的SOD活性进行分析，可知在无采油污水胁迫的对照组中斑马鱼头部的SOD活性为16.73U/mg，而在采油污水稀释浓度为0.03的全致死组中培养的斑马鱼头部的SOD活性为239.09U/mg。说明在没有采油污水污染的情况下斑马鱼的SOD的基础活性比较低，在全致死浓度时其活性在斑马鱼头部中上升了14倍左右，变化非常明显。因此可以通過检测斑马鱼头部的SOD活性的变化去判断斑马鱼是否受到水中污染物的毒害，进而判断环境污染的程度，为环境检测提供实验依据，为采油污水的综合化处理和环境污染的治理提供简便的检测手段。另外本研究发现在大庆地区采油污水中斑马鱼全致死浓度为该污水的33倍稀释浓度，反映出目前大庆地区的水源被采油污水污染较严重，采油污水的排放质量不达标，急需加强对采油污水的排放进行治理，改善大庆地区水源环境质量。
