气相色谱-质谱法测定苦苣菜、葡萄籽超临界萃取物中的脂肪酸含量

    张文 张琪玮 闫君 张菁菁

    

    

    

    摘 ?????要：通过气相色谱-质谱联用仪对苦苣菜、葡萄籽的CO2超临界萃取物进行成分分析，得到主要成分为脂肪酸类，对其脂肪酸建立定性定量方法，以准确分析其萃取物的脂肪酸含量。运用优化的CO2超临界萃取方法得到苦苣菜、葡萄籽提取物，通过气质联用仪及NIST谱库对提取物进行成分分析，改进气相色谱条件（色谱柱为HP-5msUI，分析时间为57 min），优化质谱条件（单反应监测模式和分段扫描），得到多种脂肪酸的定性定量方法。通过气质联用仪解析了苦苣菜CO2超临界提取物的活性成分，脂肪酸测定方法对于植物提取物具有较好的线性关系（相關系数R均高于0.992 0）、回收率在80%～105%之间，定量限在0.002～0.010 g/kg之间，RSD均小于4.0%。测得苦苣菜萃取物中有20种脂肪酸，不饱和脂肪酸占总脂肪酸的83.5%，葡萄籽萃取物中检出了10种脂肪酸，不饱和脂肪酸占总脂肪酸的91.74%。脂肪酸测定方法操作简便、灵敏度高，缩短了检验时间，适用于植物萃取物中脂肪酸的测定。解析了苦苣菜的活性成分，得到了苦苣菜、葡萄籽中脂肪酸的准确含量。

    关 ?键 ?词：GC-MS; CO2超临界; 苦苣菜; 葡萄籽; 脂肪酸

    中图分类号：O657 ??????文献标识码： A ??????文章编号： 1671-0460（2019）04-0876-05

    Abstract： A method for the determination of fatty acids by gas chromatography-mass spectrometry was established to analyze the fatty acids in the supercritical CO2 extracts of Sonchus oleraceus L. and grape seeds. By using the improved gas chromatography conditions （HP-5msUI column was adopted and analysis time was 57 min.）， the optimized mass spectrometry conditions （selected ion monitoring mode and segment detection） were used to analyze the types and contents of fatty acids of supercritical CO2 extracts of Sonchus oleraceus L. and grape seeds. This method had a good linear relationship， the correlation coefficient（R）was above 0.992 0， the recoveries were within 80%～105%， the RSD of precision was less than 4.0%，the quantitative limit was between 0.002 and 0.010 g/kg. It was found that there were 20 kinds of fatty acids in that extract of the Sonchus oleraceus L.， the unsaturated fatty acid accounted for 83.5% of the total fatty acid， 10 kinds of fatty acids were detected in the grape seed extract， and the unsaturated fatty acid accounted for 91.74% of the total fatty acid. The method is simple and sensitive， and it can reduce the cost of testing， shorten the testing time. It is applicable to the determination of fatty acids in plant extracts.

    Key words： GC-MS; Supercritical CO2 fluid extraction; Fatty acid; Sonchus oleraceus L.; Grape seeds

    苦苣菜（Sonchus oleraceus L.），又名北败酱，是菊科（Compositae）苦苣菜属（Sonchus）两年或多年生草本植物，作为中药材曾收载于《中国药典》[1，2]，具有清热解毒、消肿排脓、益肝利尿等功效，还具有抗肿瘤、治疗急性痢疾等作用[2-5]，在民间它被称做滇苦菜、苦苦菜、野芥子等，作为野菜食用历史悠久[1，2]。已报道的关于苦苣菜的研究，主要集中于其化学成分的分析及药理实验[6，7]，对苦苣菜营养成分的研究鲜有报道。本实验通过CO2超临界仪对苦苣菜进行萃取，运用GC-MS对其成分进行解析，得到脂肪酸类化合物为其主要成分之一，在此基础之上，建立苦苣菜中脂肪酸的测定方法，为其开发应用及成分的解析奠定了基础。

    葡萄籽油脂含量较高，特别是不饱和脂肪酸——亚油酸含量高达58%～78%，是良好的油料作物之一，近年葡萄籽油提取工艺的相关研究已较完善[8，9]，而其中脂肪酸的组成及每种脂肪酸的准确含量，是评价葡萄籽油品质优劣以及真假的主要因素[10，11]，因此，准确定性定量脂肪酸为进一步开发葡萄籽、丰富营养资源能提供理论依据。

    目前，脂肪酸的检测方法为《GB5009.168- 2016》[12]，而植物提取物成分较复杂，对脂肪酸的干扰杂质较多，在日常工作中还存在分析时间长（85 min）、耗材特殊（气相色谱柱为100 m的专属柱）、部分脂肪酸色谱峰重合、不易分离等问题。已报道的脂肪酸方法为通过GC-MS的面积归一化法测其总含量，或者通过谱库检索单一脂肪酸，但该法定性存在一定误差。本试验通过GC-MS建立脂肪酸的单离子检测扫描（SIM）方法，优选出脂肪酸的特征离子，采用分时间段扫描，避开同系物的干扰，能够准确测定植物提取物（低油脂的苦苣菜、高油脂的葡萄籽）中的脂肪酸含量。本方法具有较高灵敏度、检出限低、分离效果好、分析时间短、定量准确，适用于天然产物提取物中脂肪酸的准确定性定量检测，为天然产物的脂肪酸研究开发奠定基础。

    1 ?实验部分

    1.1 ?仪器与试剂

    仪器：7890B/7000D气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent公司），Sp-ed超临界萃取设备（美国应用分离公司），RV10旋转蒸发仪（德国IKA公司），Centrifuge 5810R超低温高速离心机（德国Eppendorf公司），Milli-Q IQ7000超纯水系统（美国Millipore公司），BSA224S-CW电子天平（德国Sartorius公司）;SCG-6智能恒温槽（宁波新芝），MS3 digital涡旋混合器（德国IKA公司），微孔滤膜0.22 μm有机系滤膜。

    实验试剂：37种脂肪酸甲酯混合标准溶液（批号XA17032V，Sigma-Aldrich公司）、单个脂肪酸甲酯对照品（Dr.Ehrensorfer GmbH，純度均98.5%），正庚烷（色谱纯）、异辛烷（色谱纯）、氢氧化钾、甲醇、无水硫酸钠、硫酸氢钠、无水乙醇。

    样品为甘肃产裂叶苦苣菜、红提葡萄籽。

    1.2 ?方法

    1.2.1 ?对照品溶液的制备

    精密量取1.00 mL脂肪酸甲酯混合标准溶液移至10 mL容量瓶中，精密称取10 mg单个脂肪酸甲酯对照品于10 mL容量瓶中，分别用正庚烷稀释定容，贮存于-18 ℃冰箱中。低浓度标准溶液以此为母液进行相应的稀释。

    1.2.2 ?色谱条件

    色谱柱：HP-5msUI（30 m×250 μm，0.25 μm）;载气：高纯氮气;流量1 mL/min;进样量：1 μL;进样口：250 ℃;平衡时间0.5 min;隔垫吹扫3 mL/min;压力10.523 psi，不分流;升温程序：

    100 ℃（5 min） 10 ℃/min 180 ℃（3 min） 2 ℃/min 200 ℃（10 min） 5 ℃/min 230 ℃（15min）。

    1.2.3 ?质谱条件

    电离模式：电子轰击源（EI），电子能量70 eV;离子源温度：230 ℃;传输线温度：280 ℃;溶剂延迟时间：2.5 min;离子监测模式：单反应监测模式（SIM）;选择离子监测方式的质谱参数见表1。

    1.2.4 ?样品处理过程

    样品制备：分别称取苦苣菜、葡萄籽在50 ℃恒温下干燥10～12 h至干燥，粉碎至40～200目待用。

    CO2超临界萃取条件：分别称取15 g干燥粉碎后的苦苣菜、葡萄籽粉末，填充于萃取釜内，萃取条件为：CO2流量17～20 kg/h，分离釜Ⅰ温度35 ℃，分离釜Ⅱ温度45 ℃，萃取温度40 ℃，萃取压力25 MPa，萃取时间120 min[13，14]。萃取制得苦苣菜、葡萄籽的超临界萃取物。

    样品前处理：将提取物（粉末或膏状物）准确称取适量（50 mg左右）至具塞试管中，加入4.0 mL异辛烷溶解试样，使试样溶解后加入 200 μL 氢氧化钾甲醇溶液（2 mol/L），盖上玻璃塞猛烈振摇30 s后静置至澄清。加入约1 g硫酸氢钠，猛烈振摇，中和氢氧化钾。待盐沉淀后，将上层溶液移至上机瓶中，过0.22 μm有机滤膜，待测。

    2 ?结果与讨论

    2.1 ?GC-MS对超临界提取物的成分分析

    用正己烷将苦苣菜超临界提取物稀释100倍后进气质联用仪进行分析，设置气相温度为50 ℃至320 ℃，覆盖各物质出峰的温度范围，全扫描（SCAN）模式下的扫描范围为（m/z）50～550，运用NIST谱库检索所有峰，得到有效的成分见表2。通过GC-MS得到苦苣菜超临界提取物的主要成分为：植醇、新植二烯、脂肪酸类、维生素E、谷甾醇、白桦脂醇、羽扇醇酯类等。

    2.2 ?色谱条件

    根据脂肪酸甲酯的沸点，选取色谱柱的起始温度为60、80、100 ℃进行比较，发现脂肪酸甲酯的分离、峰形在这三种温度下不受影响，仅色谱峰的保留时间因起始温度升高而延后，为了缩短检测时长，选择起始温度为100 ℃，并优化了程序升温的条件（1.2.2）。1.2.2的方法与国标中的升温条件相比，第二、三段升温速率较国标中快，且每一段的保留时间均缩短，但对峰形及分离度没有影响，本法较国标方法缩短了分析时间。然而由于本试验使用HP-5msUI色谱柱，对丁酸甲酯、己酸甲酯有所影响，但对于植物提取物的分析能够满足要求。另外顺-15-二十四碳一烯酸甲酯出峰时间较迟，延长230 ℃下的升温时间也未检测到该物质峰，使用HP-88的色谱柱也未检测到，分析原因为该物质的响应较小，应加大该物质的检测浓度和提高仪器的灵敏度。脂肪酸混合标准溶液的总离子流图见图1。

    2.3 ?质谱条件

    脂肪酸甲酯在色谱柱上的出峰时间与碳链长短相关，同分异构体的脂肪酸只是空间结构不同，化学、物理性质相似，因此出峰时间重叠，很难分离，采用质谱的选择离子监测（SIM）模式，找出每种脂肪酸的特征离子，并通过时间段将多种脂肪酸分段采集，可较好分离每种脂肪酸，特征离子见表2。

    2.4 ?标准曲线及检出限

    用正庚烷稀释混合标准储备液，配制为0、25、50、100、200、400、600、800 μg/L的31种脂肪酸混合标准溶液，在所述色谱和质谱条件下测定，记录峰面积，绘制峰面积-浓度标准曲线，并计算各脂肪酸线性回归方程及相关系数。在相应的浓度范围内，31种脂肪酸线性良好，相关系数R均在0.9920以上。以S/N≥10确定31种脂肪酸的定量限，线性方程及定量限见表3。

    2.5 ?回收率及样品测定

    采用本方法对苦苣菜、葡萄籽的超临界提取物进行测定，苦苣菜提取物中检出了20种脂肪酸，不饱和脂肪酸占总脂肪酸的83.5%，葡萄籽提取物中检出了10种脂肪酸，顺，顺-9，12-十八碳二烯酸甲酯、顺-9-十八碳-烯酸甲酯含量高达68.41%，10.41%，不饱和脂肪酸占总脂肪酸的91.74%。

    精密称取苦苣菜提取物，添加如表4的脂肪酸甲酯混合标准溶液，按照前处理方法处理加标样品，并对加标样品进行重复性试验（n=6），计算回收率和RSD，结果见表4。得到31种脂肪酸的回收率在80%～105%之间，重复性在1.3%～3.9%之间。

    3 ?结 论

    本实验建立了植物提取物中脂肪酸的气相色谱-质谱联用仪测定方法，该方法改进了气相条件，优化了质谱条件，解决了复杂样品中脂肪酸的测定时杂质干扰的问题，具有较好得回收率，定性、定量准确。并对甘肃产苦苣菜、葡萄籽的超临界提取物进行测定，得到苦苣菜提取物中含有20种脂肪酸，不饱和脂肪酸占总脂肪酸的83.5%，葡萄籽提取物中检出了10种脂肪酸，不飽和脂肪酸占总脂肪酸的91.74%。

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