鬼针草总黄酮有效部位质量控制研究

    孙萌 周洪雷 张玲

    摘 ?????要：建立了鬼针草总黄酮有效部位的质量控制方法。分别采用分光光度法测定鬼针草总黄酮的含量，高效液相色谱法测定鬼针草中有效成分芦丁和金丝桃苷的含量。鬼针草总黄酮的含量均在50%以上。芦丁在5.12～128.0μg/mL（r=0.999 6）、金丝桃苷在4.96～124.0μg/mL（r=0.999 5）范围内线性良好，芦丁平均回收率为98.76%，RSD%=1.83%;金丝桃苷回收率为97.39%，RSD%=2.41%。建立的质量控制方法可有效控制鬼针草总黄酮有效部位的质量。

    关 ?键 ?词：鬼针草总黄酮; 含量; ?HPLC

    中图分类号：TQ 28 ??????文献标识码： A ??????文章编号： 1671-0460（2018）03-0467-04

    Abstract： To establish the method for quality control of total flavones of Bidens pilosa L.， the content of total flavones was determined by spectrophotometric method， and HPLC was used to measure the contents of rutin and hyperoside. ?The results showed that， the content of total flavones was higher than 50%，the linear range of rutin was 5.12～128.0 μg/mL（r=0.999 6） and the average recovery was 98.76%， the linear range of hyperoside was 4.96～124.0 μg/mL（r=0.9995） and the average recovery was 97.39%. So the established method can be used for quality control of total flavones in Bidens pilosa L..

    Key words：Total flavones of Bidens pilosa L.; Content; HPLC

    鬼針草为菊科（Composite）鬼针草属Bidens L.一年生植物鬼针草Bidens bipinnataL.的干燥全草。鬼针草属植物为一年生草本，在全球约有 240 个种，资源丰富。广泛分布在热带以及亚热带地区，在南北美洲种类最为丰富。鬼针草生长于湿地、河岸、荒地、山坡及路边等处，易于采集使用，在我国，鬼针草有9种2变种，主产于东北、华北、华东、及陕西、甘肃、四川等地[1，2]。

    鬼针草为中国民间常用草药，药用历史悠久，其根、茎、叶或全草均可作为药用材料。唐代陈藏器的《本草拾遗》记载：“鬼针草，味苦平，无毒”。《中药大辞典》中记载有鬼针草无毒、味苦、性平，具有清热解毒、散瘀消肿之功效。临床用于治疗肾炎、腹泻肠炎、痢疾、肝炎、胃痛、咽喉肿痛等，近年研究发现鬼针草可用于治疗感冒、甲状腺肿、慢性炎症、糖尿病、高血压等代谢性疾病[3，4]，以及感染性疾病和疮疖肿痛等[5，6]

    鬼针草在国外也得到很好的应用，例如在墨西哥，花、叶用于治疗胃病和糖尿病;在印度全草用于治疗风湿和炎症;在俄国，该植属用于治疗伤风感冒、咽喉肿痛等） [7-10]。

    鬼针草的化学成分比较复杂，成分比较明确。其主要成分为黄酮（包括橙酮、黄酮、查耳酮、黄酮醇、二氢黄酮等）、烯炔类（目前主要有19种化合物）、挥发油（主要含有脂肪烷和脂肪酸类，还含有少量的醛、酮烯等）、氨基酸（含有天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、赖氨酸等17种氨基酸，其中8种为人体必需氨基酸）及微量元素以及生物碱、蒽醌苷、糖、胡萝卜素、维生素等[11-13]。

    本文采用紫外分光光度法测定药用部位总黄酮的含量，采用高效液相色谱法测定鬼针草药用部位中芦丁和金丝桃苷的含量，并建立了相应的方法学。以此作为控制鬼针草总黄酮的指标之一，为开发利用鬼针草资源提供相关参考。

    1 ?实验仪器与试药

    Agilient1100 高效液相色谱仪（美国安捷伦）;紫外可见分光光度计（UV-3600Plus，岛津中国）;真空干燥箱（南京天利制药设备有限公司）;鬼针草药总黄酮（自制）。芦丁（供含量测定用，批号100080-200707）、金丝桃苷（供含量测定用，批号111521-201004）对照品均购于中国药品生物制品检定所，HPLC实验所用试剂均为色谱纯，实验用水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为国产分析纯（AR）。

    2 ?实验方法与结果

    2.1 ?总黄酮的测定

    2.1.1 ?供试品溶液的制备

    精密称取鬼针草总黄酮50 mg，置于50 mL容量瓶中， 加入乙醇适量，超声溶解， 放冷后， 加乙醇至容量瓶刻度，充分摇匀，密闭保存，备用。

    2.1.2 ?对照品溶液的制备

    取120 ℃干燥至恒重的芦丁对照品，精密称定10.8 mg， 置50 mL容量瓶中，加适量乙醇溶解后，再加入乙醇至刻度，摇匀，得到浓度为0.216 mg·mL-1的芦丁对照品溶液。

    2.1.3 ?线性关系

    取2.1.2制备的芦丁对照品溶液，精密吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分别置于25 mL的容量瓶之中， 各容量瓶再分别加入蒸馏水至6 mL，5 %亚硝酸钠1 mL，摇匀， 放置6 min 后，10 %硝酸铝1 mL， 充分摇匀后放置6 min;加入NaOH试液10 mL后加蒸馏水直至刻度，充分摇匀，放置15 min，以上述相应试剂作为空白对照溶液，于UV-3600Plus紫外可见分光光度计，在190～760 nm范围内进行全波长扫描，得样品的最大吸收波长为510 nm ， 故选择510 nm为检测波长。以吸光度（Y）为纵坐标， 浓度（X）为横坐标，绘制测定标准曲线， 计算回归方程为：Y=11.436X-0.0158（r=0.999 5）。结果表明， 芦丁检测浓度在8.64～51.84 ?g·mL-1 范围内与其吸光度呈良好的线性关系。

    2.1.4 ?精密度试验

    取2.1.1制备的供试品溶液，按照上述测定条件测定供试品吸收度，重复测定6 次，计算，结果表明结果RSD为0.88 %，显示仪器精密度良好。

    2.1.5 ?稳定性试验

    取2.1.1制备的供试品溶液，室温放置，每隔一段时间测定供试品吸光度，计算，结果RSD为0.96 %，表明供试品溶液在30 min 内基本稳定。

    2.1.6 ?重现性试验

    精密称取同一批鬼针草总黄酮样品6 份，分别按2.1.1方法制备供试品溶液，测定吸光度，计算样品RSD为1.26%，表明该测定方法具有良好的重现性。

    2.1.7 ?加样回收率试验

    取已知含量的鬼针草总黄酮样品，精密称量6份，每份25 mg，分别精密加入芦丁对照品适量，按照2.1.1方法制备供试品溶液，进行吸光度测定，根据2.1.3项下回归方程计算，结果表明平均回收率为99.12%， RSD为1.98%。

    2.1.8 ?样品含量测定

    精密称取5 批鬼针草黄酮样品各50 mg，分别按上述方法制备供试品溶液并测定吸光度，根据回归方程计算样品中总黄酮含量，结果表明5 批鬼针草总黄酮含量分别为50.22%、53.15%、51.98%、52.36%、52.58%。

    2.2HPLC含量的测定

    2.2.1 ?色谱条件

    Welch materials C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）;乙腈-0.2%冰醋酸梯度洗脱，洗脱程序为0～5 min，5%乙腈;5～15 min，5%→15%乙腈;15～25 min，15%→25%乙腈;25～35 min，25%→30%乙腈;35～45 min，30%→60%乙腈;45～60 min，60%→5%乙腈;流速：1 mL/min;柱温：30℃;检测波长：360 nm;进样量10 μL。色谱图见图 1、图2。

    2.2.2 ?对照品溶液制备

    分别精密称定芦丁和金丝桃苷对照品适量，置100 mL容量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，制备成25.6 μg/mL的芦丁对照品液和24.8 μg/mL的金丝桃苷对照品液。

    2.2.3 ?供试品溶液制备

    精密称取总黄酮约20 mg，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，备用。

    2.2.4 ?线性关系

    精密吸取0，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0 mL系列对照品溶液于10 mL容量瓶中，用70%甲醇稀释定容，按色谱条件测定，以峰面积A对标准品质量浓度作图，得芦丁回归方程：Y=1216.56X+458.76（r=0.9996），金丝桃苷回归方程：Y=979.88X-127.37（r=0.999 5）。芦丁在5.12～128.0μg/mL、金丝桃苷在4.96～124.0μg/mL范围内线性关系良好。

    2.2.5 ?精密度试验

    精密吸取芦丁对照品溶液10 μL，重复进样6次，记录色谱图，测定芦丁色谱峰峰面积，计算表明芦丁的RSD分别为1.81%。同样方法计算金丝桃苷的RSD为1.91%。表明该仪器具有良好精密度。

    2.2.6 ?稳定性试验

    精密吸取芦丁和金丝桃苷對照品溶液分别于0、1、2、4、6、8、12 h进样，记录色谱图，测定吸收峰面积，结果表明芦丁和金丝桃苷的RSD分别为2.05%和1.98%，表明芦丁和金丝桃苷对照品溶液在12 h内基本稳定。

    2.2.7 ?重复性试验

    取同一批鬼针草总黄酮样品，精密称取6份，分别按照2.2.3方法制备供试品溶液，进样，记录色谱图，计算芦丁色谱峰的峰面积，RSD为2.37%。同样方法计算金丝桃苷的RSD为2.42%。

    2.2.8 ?回收率试验

    取已知含量的鬼针草总黄酮样品，精密称定约10 mg，共取6份，精密加入芦丁对照品适量，制备样品、测定后计算含量，平均回收率为98.76%，RSD为1.83%。 同样方法测定金丝桃苷平均回收率为97.39%，RSD为2.41%。

    2.2.9 ?样品测定

    取5批鬼针草总黄酮样品，同2.2.3制备供试品溶液，分别精密吸取10 μL，注入高效液相色谱仪测定，记录色谱图，按峰面积用外标法计算含量，结果表明总黄酮中芦丁的含量为5.95%，金丝桃苷的含量为4.21%。

    3 ?结 论

    3.1 ?样品处理

    本实验测定鬼针草总黄酮的含量时，由于鬼针草中叶绿素含量较多，导致提取液颜色较深，通过查阅文献，何微[14]等在进行用分光光度法测定枸杞叶中总黄酮的实验中，比较了经过石油醚脱色后的总黄酮与不脱色的枸杞叶总黄酮的含量的含量基本一致，样品提取过程中可不用脱色处理。前期我们在制备鬼针草总黄酮时，分别对鬼针草药材进行了石油醚脱色和不脱色，结果表明脱色和不脱色对于鬼针草总黄酮的影响不大。在测定鬼针草总黄酮含量时，石油醚脱色与否几乎不影响测定，故在测定时不用提前脱色。

    3.2 ?实验结果分析

    本文采用紫外分光光度法测定了鬼针草总黄酮的含量，并对其进行了方法学考察，结果表明紫外分光光度法测定总黄酮，方法简便、测定快速、重现性和稳定性良好，可用于鬼针草总黄酮的含量测定。

    本文建立了HPLC方法测定鬼针草总黄酮中芦丁和金丝桃苷含量的方法。该方法可对鬼针草总黄酮进行分离分析，在有对照品的前提下，能够准确进行各种成分的定量分析，准确度和灵敏度高[15]，可为鬼针草药材和总黄酮提取物质量控制的建立提供研究依据。

    3.3 ?鬼针草黄酮前景

    鬼针草是我国传统民间中草药，含有多种化学成分，其中药物的主要成分黄酮，具有多种生理活性和临床药效。药理药效实验证明，鬼针草的总黄酮具多种药用活性[16-18]。因此，从鬼针草药材中分离制备总黄酮并建立总黄酮的质量控制方法，为确定鬼针草的活性部位和活性成分，深入研究药效物质的作用机制，以及进一步合理开发和利用鬼针草提供了科学依据和重要支撑。

    参考文献：

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