竹叶黄酮的提取、纯化及抗氧化性能研究
龙旭 高静 张光辉
摘 ?????要：对竹叶中的黄酮类化合物进行提取、纯化及抗氧化性能研究。考察了大孔树脂对竹叶黄酮的吸附、解吸工艺参数，当黄酮上样量流速为1.0 mL/min，pH为5.0时，黄酮吸附率最高为80.13%。当洗脱剂乙醇流速为1.5 mL/min，乙醇浓度为60%时，黄酮解吸率最佳为90.6%。竹叶黄酮在光照、强酸、强碱条件下，自由基清除率下降明显。
关 ?键 ?词：竹叶;黄酮;抗氧化
中图分类号：R 284 ??????文献标识码： A ??????文章编号： 1671-0460（2019）02-0299-04
Abstract： The extraction， purification and antioxidation of the flavonoids from bamboo leaves were studied. The best conditions for adsorption and desorption of the flavonoids by macroporous resin were investigated. When the samples flow velocity was 1.0 mL/min and pH was 5.0， the highest adsorption amount of flavonoids was 80.13%. Meanwhile， the highest desorption amount was 90.6% when ethanol flow velocity was 1.5 mL/min and ethanol concentration was 60%. The test results of antioxidant activities showed that illumination， strong acid and alkali conditions made free radical scavenging rate of flavonoids markedly decrease.
Key words： Bamboo leaves; Flavonoids; Antioxidant
竹子是禾本科、竹亚科的多年生常绿植物，其种类较多，全世界约有70多属，约1 200余种，总种植面积达2 100万公顷[1]。竹叶在中国具有悠久的药食使用历史，竹叶黄酮是竹叶的主要功能物质，具有显著的降血脂、抗炎、抗突变、抗溃疡、抗菌、抗癌活性、降血清胆固醇、抗氧化、抗病毒、抗衰老及抗疲劳等生理活性，是一种优质的天然活性产物[2-6]。因此，以竹叶作为原料提取黄酮类有效成分对我国竹资源的充分利用具有深远的现实意义。
竹叶黄酮具有抗氧化生物活性，本研究为了获得有效利用竹叶中黄酮类物质的途径，拟通过热回流提取、大孔树脂纯化后再考察竹叶黄酮体外抗氧化性能，為竹叶的开发利用提供理论依据。
1 ?实验部分
1.1 ?实验试剂与仪器
1.1.1 ?实验试剂
竹叶（学校采摘），无水乙醇（AR，天津天力化学试剂有限公司），石油醚（AR，天津天力化学试剂有限公司），硝酸铝（AR，重庆茂业化学试剂有限公司），亚硝酸钠（AR，重庆茂业化学试剂有限公司），氢氧化钠（AR，重庆茂业化学试剂有限公司），芦丁标准品（HPLC 98%，北京万佳首化生物科技有限公司），1， 1-二苯基-2-苦肼基（DPPH，分析纯，Sigma-Aldrich公司）。
1.1.2 ?实验仪器
恒温磁力搅拌器（HJ-3A），紫外-可见分光光度计（UV1102，日本岛津），循环水多用真空泵（SHB-III），电热鼓风干燥箱（上海一恒），粉碎机（HX-200），电子分析天平，旋转蒸发仪（Buchi R-210），恒温振荡器（THZ-82A）。
1.2 ?实验步骤及表征
1.2.1 ?竹叶黄酮热回流提取
新鲜竹叶用清水清洗干净后在鼓风干燥箱中于50 ℃干燥24 h，再用粉碎机粉碎过40目筛子备用。称取竹叶细分20 g加入至回流瓶中，加200 mL 80%的无水乙醇，在80 ℃回流3 h，获得竹叶提取液。抽滤获得滤液，再对残渣重复提取2次后合并滤液，将总滤液于80 ℃旋转蒸发，去除多余溶剂获得浓缩液。为了去除浓缩液中的脂类成分，采用石油醚萃取3～5次，直至上层液呈现无色或近似无色为止。
1.2.2 ?芦丁标准曲线的绘制
精确称取芦丁标准品0.002 5 g置于小烧杯中，加40%乙醇溶解并定容于25 mL容量瓶中，即得0.1 mg/mL的芦丁标准品溶液。移取芦丁标准品溶液1.50 mL，置于10 mL容量瓶中，再加入5%的亚硝酸钠溶液0.30 mL，摇匀，放置6 min;随后加入10%硝酸铝溶液0.30 mL，摇匀，放置6 min;加入1.0 mol/L的氢氧化钠溶液4.00 mL，用40%乙醇溶液定容，摇匀，放置15 min备用。以不加芦丁标准品溶液作为空白样。将含不同浓度芦丁标准品的溶液置于紫外—分光光度计（波长范围：400～600 nm）内进行测定。
量取芦丁标准品溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加5%亚硝酸钠溶液0.30 mL，摇匀，放置6 min;加10%硝酸铝溶液0.30 mL，摇匀，放置6 min。加1.0 mol/L氢氧化钠溶液4.00 mL，用40%的乙醇溶液进行定容，摇匀，放置15 min。以不加芦丁标准品溶液作为空白样。采用紫外—分光光度法在510 nm波长处测定吸光度，以芦丁浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线。
1.2.3 ?大孔树脂预处理
以AB-8型大孔树脂对竹叶黄酮进行分离纯化。用95%的乙醇溶液浸泡24 h使其充分溶胀，然后将树脂装入填充柱，用4 BV（柱床体积）浓度为4%的盐酸溶液过柱，蒸馏水洗至中性，再用4 BV浓度为4%的氢氧化钠过柱，蒸馏水洗至中性，处理后的AB-8型树脂即可用于后续实验。
1.2.4 ?大孔树脂对竹叶黄酮的动态吸附及解吸实验
（1）上样流速对树脂吸附性能的影响
将树脂装入层析柱后连接恒流泵及样品自动收集器，在298 K时，让竹叶黄酮样品按照不同的速率上样，考察大孔树脂的吸附性能，每间隔5 mL收集流分，用紫外-可见分光光度计检测黄酮含量。
（2）进料pH对树脂吸附性能的影响
考察竹叶黄酮溶液pH值的改变对大孔树脂吸附性能的影响。通过在298 K时，控制进料浓度为1.0 mg/mL，流速为1 mL/min，进行动态吸附。
（3）洗脱剂洗脱速率对树脂解吸性能的影响
在298 K时，控制进料浓度为1.0 mg/mL，流速为1 mL/min，对大孔树脂进行上样。用100 mL的蒸馏水洗涤后，用浓度为60%的乙醇分别按照0.5，1.0，1.5 mL/min的洗脱速率对吸附在大孔树脂上的黄酮样品进行洗脱，每间隔5 mL收集流分，用紫外-可见分光光度计检测黄酮含量。
（4）洗脱剂浓度对树脂解吸性能的影响
在298 K时，控制进料浓度为1.0 mg/mL，流速为1 mL/min，对大孔树脂进行上样。用100 mL的蒸馏水洗涤后，用不同浓度的乙醇溶液按照1.0 mL/min的速率进行洗脱，每间隔5 mL收集流分，用紫外-可见分光光度计检测黄酮含量。
1.2.5 ?抗氧化研究
测定竹叶黄酮清除DPPH自由基的能力，考察其抗氧化活性。测定时，将竹叶黄酮试样配置成系列不同浓度的溶液，测定不同浓度的竹叶黄酮试样对DPPH自由基的清除率[7，8]。以浓度作为横坐标，DPPH自由基清除率作为纵坐标作图，得到竹叶黄酮浓度与自由基清除率的关系图谱。在517 nm波长下，通过测定竹叶黄酮在不同光强度和pH等条件下吸光度值的变化，对竹叶黄酮抗氧化活性的稳定性进行研究。
2 ?实验结果与分析
2.1 ?芦丁标准曲线
按照上述实验方法分析获得芦丁的标准曲线，结果如图1所示。以浓度作为横坐标，吸光度作为纵坐标，通过线性回归得到标准曲线方程为：A = 0.001 81+9.414 07C，R = 0.999 98。
2.2 ?上样流速对竹叶黄酮吸附性能的影响
上样流速对大孔树脂的吸附效率及目标成分的吸附量均存在一定的影响。通过调控上样液的流速分别为1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL/min，考察对大孔树脂吸附效果的影響，结果如图2所示。从图中可以明显看出，随着上样流速的逐渐增加，吸附量急速降低，这是由于流速过快时，竹叶黄酮中的大分子化合物与AB-8树脂的接触时间较短，导致目标成分还来不及扩散并吸附到树脂内表面就随着上样液流出。但是，当上样液流动速度较慢时，竹叶黄酮中的有效成分与大孔树脂有相对充分的时间进行吸附，所以当上样吸附速率为1.0 mL/min吸附率最高。
2.3 ?进料pH对树脂吸附性能的影响
本研究考察了黄酮原液pH分别为3.0，4.0，5.0，6.0，7.0和8.0时，树脂吸附性能的变化情况。从图3可以看出，当原液pH为5.0时树脂的吸附量最大，但逐渐增大原液pH值或减小pH值时，树脂的吸附率均有所下降。这是由于原液酸度过大时，黄酮与酸会生成烊盐并以离子的状态存在不利于吸附。当原液碱度过大时，则质子易被强碱俘获，使酚羟基上的氢解离形成酸根离子，而AB-8树脂只对分子态物质有吸附，对离子态的物质无吸附，导致黄酮与树脂的结合减弱使吸附量降低。
2.4 ?洗脱剂洗脱速率对树脂解吸性能的影响
洗脱剂流速对树脂解吸性能的影响结果如图4所示。从图4中可以看出，当洗脱液流速不同时，对应的洗脱峰位置和洗脱峰形状也会略有所差异。对比三种洗脱峰可知，洗脱剂流速为1.5 mL/min时，对应的洗脱峰峰形较窄、对称性好且基本无拖尾。但是，随着洗脱剂流速逐渐降低，峰形越来越宽且拖尾明显[9]。
2.5 ?洗脱剂浓度对树脂解吸性能的影响
改变洗脱剂乙醇的浓度对黄酮的解吸率的影响如图5所示，从图中可以看出随着乙醇浓度的增大解吸率逐渐升高，当乙醇浓度为60%时，解吸率达到90.6%。但是再增加乙醇浓度，解吸率缓慢降低。
2.6 ?光强度对竹叶黄酮抗氧化性能的影响
光对竹叶黄酮抗氧化性能的影响结果如图6所示。
从图6中可以看出，光照对DPPH自由基的清除率影响较大。在避光情况下，竹叶黄酮对自由基的清除率随时间的增长虽然有所下降但是变化不是很明显。在光照的条件下，自由基的清除率随时间增长急剧减小，这是由于竹叶黄酮类化合物中含有酚羟基，而在光照的条件下酚羟基易于被氧化[10]，因此，竹叶黄酮的抗氧化性能下降明显。
2.7 ?pH对竹叶黄酮抗氧化性能的影响
改变溶液的pH值会影响竹叶黄酮在溶液中的存在形态，从而导致其抗氧化性能发生改变（如图7）。与图3结果类似，在pH较低时，竹叶黄酮会与酸生成烊盐，导致抗氧化性能下降。而pH值较高时，黄酮中的酚羟基会发生解离，使其抗氧化性能下降。因此，当pH值在5.0时，黄酮的自由基清除率最高达到82.9%。
3 ?结 论
以竹叶作为原料，采用热回流法提取其中的竹叶黄酮，通过大孔树脂AB-8对总黄酮进行分离、纯化，当竹叶黄酮的上样流速为1.0 mL/min，样品pH值控制在5.0时，大孔树脂对竹叶黄酮的吸附率最高。当洗脱剂乙醇的流速为1.5 mL/min，浓度为60%时，黄酮的解吸率最好。通过清除DPPH自由基法考察竹叶黄酮的抗氧化性能，结果表明在光照、溶液pH过低或过高的条件下，均会导致自由基清除率急剧下降，因此，竹叶黄酮的相关制药及工艺研究均需控制溶液酸碱度和避光进行。
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