BOD5测定中的技术问题
摘要：五日生化需氧量（BOD5）是水质污染监测重要指标之一，但由于整个测定过程是一个复杂的生化过程，会受许多因素的影响。本文从稀释水、样品前处理、稀释倍数、接种液等几个影响测定结果准确性的关键因素进行了分析论述。
关键词：五日生化需氧量；样品前处理；稀释倍数；接种液
中图分类号：X131.2 文献标识码：A 文章编号：2095-672X（2017）04-0126-02
DOI：10.16647/j.cnki.cn15-1369/X.2017.04.059
Abstract： 5th biochemical oxygen demand （BOD5） is currently one of the important indicators of water quality pollution monitoring， but as a result of the whole measurement process is a complex biochemical process， will be influenced by many factors. This paper analyzes the key factors affecting the accuracy of the results， including the dilution water， the pretreatment of the sample， the dilution multiple， the inoculation fluid， etc.
Keywords： Five-day biochemical oxygen demand； Sample preparation； Dilution ratio； Inoculation fluid
生化需氧量（BOD5）是指在规定的条件下，微生物分解水中的某些可氧化的物质，特别是分解有机物的生物化学过程消耗的溶解氧，BOD5数值越大证明水中含有的有机物越多，因此污染也越严重。
测定水中生化需氧量的常用方法有稀释与接种法〔1-2〕，测定原理为：将水样充满完全密闭的溶解氧瓶中，在（ 20±1）℃的暗处培养5d±4h 或者（ 2+5） d±4h （先在 0℃～4℃的暗处培养 2d，接着在（ 20±1）℃的暗处培养 5d，即培养（ 2+5） d，分别测定培养前后水样中溶解氧的质量浓度，由培养前后溶解氧的质量浓度之差，计算每升样品消耗的溶解氧量，消耗的溶解氧越多，说明水中的有机物含量越高。影响测定生化需氧量（BOD5）准确度的因素有 pH 值、水温、无机盐、溶解氧含量、微生物的数量和种类（如硝化菌作用、 游离氯及绿胺、铜离子含量及其他化学毒性等影响）、稀释度、溶解氧测定等，综合以上因素，前五项均是对稀释水的要求。以下着重对稀释水、样品前处理、稀释倍数、接种液等影响因素进行分析探讨〔3-5〕。
1 生化需氧量（BOD5）的测定采用稀释与接种的方法。
1.1 稀释法
若试样中的有机物含量较多，BOD5的质量浓度大于6mg/L，且样品中有足够微生物，采用稀释法测定。
待测试样的温度达到（ 20±2） ℃ ，若试样中溶解氧浓度低，需要用曝气装置曝气 15 min，充分振摇赶走样品中残留的气泡；若样品中氧过饱和，将容器的 2/3 体积充满样品，用力振荡赶出过饱和氧，然后根据试样中微生物含量情况确定测定方法。
稀释法测定，需选择合适的稀释倍数，然后用稀释水稀释。
1.2 稀釋接种法
若试样中的有机物含量较多，BOD5的质量浓度大于6mg/L，样品中无足够微生物，采用稀释接种法测定。
稀释接种法测定，用接种稀释水稀释样品。若样品中含有硝化细菌，有可能发生硝化反应，需在每升试样培养液中加入 2 ml 丙烯基硫脲硝化抑制剂。
2 稀释水
稀释水是在5～20L的玻璃瓶中加入一定量的水，控制水温在（20±1）℃，用曝气装置至少曝气1h，使稀释水中的溶解氧达到8 mg/L以上。使用前每升水加入磷酸盐、硫酸镁、氯化钙、氯化铁四种盐溶液，混匀，20℃保存。在曝气的过程中防止污染，特别是防止带入有机物、金属、氧化物或还原物。
稀释水的质量好与坏，直接影响BOD5的测定结果。它是通过空白值的大小反映出来的。在分析方法中对稀释水要求是BOD5<0.2mg/L。一般情况下，在稀释水中加入的化学试剂量不大，而且都是分析纯以上的级别，可以认为对稀释水的质量影响不大。而影响稀释水的质量的主要因素是实验用水的质量，因此BOD5用的纯水必须具有较高的质量，我们在实验室里用的测定BOD5的纯水由离子交换水（电导率<2μS/cm）再通过活性炭柱（活性炭要经过200℃活化），这样生产出来的水，既去掉了阴、阳离子，又去掉了有机物，其水质足以满足测定BOD5的要求。经处理的水配制的稀释水，可以测定较清洁的没有被有机物污染的地表水。
稀释水中氧的质量浓度不能过饱和，使用前需开口放置1h，且应在24h内使用。剩余的稀释水应弃去。
3 样品的前处理
样品采集后应低温存储运输。到达实验室后，培养之前，通过水浴快速升温到 20℃用于稀释培养。 当稀释后的样品 pH值不在 6～8 （最佳 7～7.5）范围内时，应当用盐酸或氢氧化钠溶液调节 pH 值至 6～8；含有游离氯或结合氯时，采用加入适量亚硫酸钠溶液去除；含有大量颗粒物的样品，测定前用水浴超声振荡器进行均质化处理；含有藻类的样品，因藻类呼吸作用改变样品中溶解氧，故测定前应用滤孔为 1.6μm 的滤膜过滤；若样品的含盐量低，电导率小于 125μS/cm 时，则需加入适量的盐溶液，使电导率大于 125μS/cm。
4 稀释倍数
测定BOD5的经典方法是稀释接种法，由于稀释比不同导致测定误差会很大，稀释倍数的确定是该方法的关键技术之一，受污染的水，由于当天溶解氧较低，如果不稀释，第五天的溶解氧会小于1mg/L，可能造成结果偏低，影响测定的准确性。
稀释倍数的确定原则是样品稀释的程度应使消耗的溶解氧质量浓度不小于 2 mg/L，培养后样品中剩余溶解氧质量浓度不小于 2 mg/L，且试样中剩余的溶解氧的质量浓度为开始浓度的 1/3～2/3 为最佳。
选择适宜的稀释倍数，是测定BOD5成败的重要因素之一。
（1）对于没有被有机物污染的较清洁的地表水，可根据测定的溶解氧来决定它的稀释倍数。溶解氧含量是在7～9mg/L，样品不需要稀释，可直接培养。溶解氧含量在5～7mg/L，样品可稀释2倍。
（2）对于测定被污染的地表水及工业废水，要根据该水样的CODCr值，按分析方法决定三个稀释倍数。对于CODCr值较高的水样要进行二级或三级稀释。在每级稀释时，最好用容量瓶。
根据废水类型确定样品的BOD5与总有机碳BOD5/ TOC、高锰酸盐指数BOD5/CODmn 和化学需氧量BOD5/CODcr的比值R，由此估算出BOD5的浓度范围，确定稀释倍数见表1、表2。
由表 1 中选择适当的 R 值，计算 BOD5 的期望值：ρ = R·Y
式中： ρ ——五日生化需氧量浓度的期望值， mg/L；
Y——总有机碳（ TOC）、高锰酸盐指数（ IMn）或化学需氧量（ CODCr）的值， mg/L。
由估算出的 BOD5 的期望值，按表 2 确定样品的稀释倍数。
5 接种液及接种稀释水
如果测定被污染的地表水及某些行业的工业废水，就需要在稀释水中加入适量的接种液，加入接种液的目的，是将能分解有机物的微生物引入到稀释水中去，这样在培养的五天中，生化过程才能顺利进行。加入接种液的稀释水，就叫接种稀释水。
接种稀释水是根据接种液（可购买接种微生物用的接种物质，接种液的配制和使用按说明书的要求操作，也可依污水自行配制）的来源不同，每升稀释水中加入适量接种液：城市生活污水和污水处理厂出水加 1～10 ml，河水或湖水加 10～100 ml，将接种稀释水存放在（ 20±1） ℃ 的环境中，当天配制当天使用。接种稀释水 pH 值为 7.2， BOD5 应小于 1.5 mg/L。
实际测定中，我们是用生活污水做接种液，这样样品就需要高倍的稀释，否则结果偏低。接种稀释水中，接種液的加入量，视其接种液的质量及被测水样的BOD5的大小而定，有时在测定BOD5标准样品时，结果偏低，很可能就是稀释水中没有加入接种液，或者加入的量不够的缘故。
6 培养温度
有机物的降解速率，是与温度成正比例的，温度相差1℃，将会引起5%左右的误差。所以不可忽视培养温度的影响，应严格控制在（20±1）℃。
7 培养瓶的体积
目前市售的培养瓶体积，一般都在310～350ml之间不等，实验中感觉到，这一体积有点偏大，更合适的体积应在220ml左右，在测试时，每一对培养瓶（当天和第五天）的体积，应尽量保持相等，这样可以减少测定误差。
8 质量保证与质量控制
8.1 空白试样
每一批样品做两个分析空白试样，稀释法空白试样的测定结果不能超过 0.5 mg/L，非稀释接种法和稀释接种法空白试样的测定结果不能超过 1.5 mg/L，否则应检查可能的污染来源。
8.2 接种液、稀释水质量的检查
每一批样品要求做一个标准样品，样品的配制方法如下：取 20 ml 葡萄糖-谷氨酸标准溶液于稀释容器中，用接种稀释水稀释至1000 ml，测定 BOD5，结果应在 180～230 mg/L 范围内，否则应检查接种液、稀释水的质量。
8.3 平行样品
每一批样品至少做一组平行样，计算相对百分偏差 RP。当 BOD5 小于 3 mg/L 时， RP 值应≤±15%；当 BOD5 为 3～100 mg/L 时， RP 值应≤±20%；当 BOD5 大于 100 mg/L 时， RP 值应≤±25%。
9 精密度和准确度
稀释法和稀释接种法的对比测定结果重现性标准偏差为 11 mg/L，再现性标准偏差为 3.7～22 mg/L。
10 结束语
用接种稀释法，测定BOD5，方法比较繁琐，时间也长，影响测定因素又多，所以要想得到一个比较满意的实验结果，在分析的整个过程中，对每一步操作都应特别注意，实验用水的质量，接种液的质量及种类、样品的前处理、稀释倍数的选择都是很重要影响因素，实际操作中必须高度重视。
参考文献
[1]环境保护部.HJ 505-2009.水质五日生化需氧量（ BOD5）的测定稀释接种法[S].北京：中国标准出版社，2009.
[2]水和废水监测分析方法编写委员会.水和废水监测分析方法（第四版）[M].北京：中国环境科学出版社，2009.
[3]杨斌，刘静，陈曜.生化需氧量（BOD5）接种液的获取方法以及加入量的研究[J].环境科学导刊，2010（1）：93-94.
[4]杨立武.BOD5测定常见影响因素及其技巧的探讨[J].科技创新与应用，2016（30）： 162.
[5]杨艳，郝燕，刘晓梅.生化需氧量（BOD5）测定影响因素[J].环境研究与监测，2011，24（2）：67-68.
作者简介：刘恋（1988-），女，理学学士，助理工程师，研究方向为环境监测。
关键词：五日生化需氧量；样品前处理；稀释倍数；接种液
中图分类号：X131.2 文献标识码：A 文章编号：2095-672X（2017）04-0126-02
DOI：10.16647/j.cnki.cn15-1369/X.2017.04.059
Abstract： 5th biochemical oxygen demand （BOD5） is currently one of the important indicators of water quality pollution monitoring， but as a result of the whole measurement process is a complex biochemical process， will be influenced by many factors. This paper analyzes the key factors affecting the accuracy of the results， including the dilution water， the pretreatment of the sample， the dilution multiple， the inoculation fluid， etc.
Keywords： Five-day biochemical oxygen demand； Sample preparation； Dilution ratio； Inoculation fluid
生化需氧量（BOD5）是指在规定的条件下，微生物分解水中的某些可氧化的物质，特别是分解有机物的生物化学过程消耗的溶解氧，BOD5数值越大证明水中含有的有机物越多，因此污染也越严重。
测定水中生化需氧量的常用方法有稀释与接种法〔1-2〕，测定原理为：将水样充满完全密闭的溶解氧瓶中，在（ 20±1）℃的暗处培养5d±4h 或者（ 2+5） d±4h （先在 0℃～4℃的暗处培养 2d，接着在（ 20±1）℃的暗处培养 5d，即培养（ 2+5） d，分别测定培养前后水样中溶解氧的质量浓度，由培养前后溶解氧的质量浓度之差，计算每升样品消耗的溶解氧量，消耗的溶解氧越多，说明水中的有机物含量越高。影响测定生化需氧量（BOD5）准确度的因素有 pH 值、水温、无机盐、溶解氧含量、微生物的数量和种类（如硝化菌作用、 游离氯及绿胺、铜离子含量及其他化学毒性等影响）、稀释度、溶解氧测定等，综合以上因素，前五项均是对稀释水的要求。以下着重对稀释水、样品前处理、稀释倍数、接种液等影响因素进行分析探讨〔3-5〕。
1 生化需氧量（BOD5）的测定采用稀释与接种的方法。
1.1 稀释法
若试样中的有机物含量较多，BOD5的质量浓度大于6mg/L，且样品中有足够微生物，采用稀释法测定。
待测试样的温度达到（ 20±2） ℃ ，若试样中溶解氧浓度低，需要用曝气装置曝气 15 min，充分振摇赶走样品中残留的气泡；若样品中氧过饱和，将容器的 2/3 体积充满样品，用力振荡赶出过饱和氧，然后根据试样中微生物含量情况确定测定方法。
稀释法测定，需选择合适的稀释倍数，然后用稀释水稀释。
1.2 稀釋接种法
若试样中的有机物含量较多，BOD5的质量浓度大于6mg/L，样品中无足够微生物，采用稀释接种法测定。
稀释接种法测定，用接种稀释水稀释样品。若样品中含有硝化细菌，有可能发生硝化反应，需在每升试样培养液中加入 2 ml 丙烯基硫脲硝化抑制剂。
2 稀释水
稀释水是在5～20L的玻璃瓶中加入一定量的水，控制水温在（20±1）℃，用曝气装置至少曝气1h，使稀释水中的溶解氧达到8 mg/L以上。使用前每升水加入磷酸盐、硫酸镁、氯化钙、氯化铁四种盐溶液，混匀，20℃保存。在曝气的过程中防止污染，特别是防止带入有机物、金属、氧化物或还原物。
稀释水的质量好与坏，直接影响BOD5的测定结果。它是通过空白值的大小反映出来的。在分析方法中对稀释水要求是BOD5<0.2mg/L。一般情况下，在稀释水中加入的化学试剂量不大，而且都是分析纯以上的级别，可以认为对稀释水的质量影响不大。而影响稀释水的质量的主要因素是实验用水的质量，因此BOD5用的纯水必须具有较高的质量，我们在实验室里用的测定BOD5的纯水由离子交换水（电导率<2μS/cm）再通过活性炭柱（活性炭要经过200℃活化），这样生产出来的水，既去掉了阴、阳离子，又去掉了有机物，其水质足以满足测定BOD5的要求。经处理的水配制的稀释水，可以测定较清洁的没有被有机物污染的地表水。
稀释水中氧的质量浓度不能过饱和，使用前需开口放置1h，且应在24h内使用。剩余的稀释水应弃去。
3 样品的前处理
样品采集后应低温存储运输。到达实验室后，培养之前，通过水浴快速升温到 20℃用于稀释培养。 当稀释后的样品 pH值不在 6～8 （最佳 7～7.5）范围内时，应当用盐酸或氢氧化钠溶液调节 pH 值至 6～8；含有游离氯或结合氯时，采用加入适量亚硫酸钠溶液去除；含有大量颗粒物的样品，测定前用水浴超声振荡器进行均质化处理；含有藻类的样品，因藻类呼吸作用改变样品中溶解氧，故测定前应用滤孔为 1.6μm 的滤膜过滤；若样品的含盐量低，电导率小于 125μS/cm 时，则需加入适量的盐溶液，使电导率大于 125μS/cm。
4 稀释倍数
测定BOD5的经典方法是稀释接种法，由于稀释比不同导致测定误差会很大，稀释倍数的确定是该方法的关键技术之一，受污染的水，由于当天溶解氧较低，如果不稀释，第五天的溶解氧会小于1mg/L，可能造成结果偏低，影响测定的准确性。
稀释倍数的确定原则是样品稀释的程度应使消耗的溶解氧质量浓度不小于 2 mg/L，培养后样品中剩余溶解氧质量浓度不小于 2 mg/L，且试样中剩余的溶解氧的质量浓度为开始浓度的 1/3～2/3 为最佳。
选择适宜的稀释倍数，是测定BOD5成败的重要因素之一。
（1）对于没有被有机物污染的较清洁的地表水，可根据测定的溶解氧来决定它的稀释倍数。溶解氧含量是在7～9mg/L，样品不需要稀释，可直接培养。溶解氧含量在5～7mg/L，样品可稀释2倍。
（2）对于测定被污染的地表水及工业废水，要根据该水样的CODCr值，按分析方法决定三个稀释倍数。对于CODCr值较高的水样要进行二级或三级稀释。在每级稀释时，最好用容量瓶。
根据废水类型确定样品的BOD5与总有机碳BOD5/ TOC、高锰酸盐指数BOD5/CODmn 和化学需氧量BOD5/CODcr的比值R，由此估算出BOD5的浓度范围，确定稀释倍数见表1、表2。
由表 1 中选择适当的 R 值，计算 BOD5 的期望值：ρ = R·Y
式中： ρ ——五日生化需氧量浓度的期望值， mg/L；
Y——总有机碳（ TOC）、高锰酸盐指数（ IMn）或化学需氧量（ CODCr）的值， mg/L。
由估算出的 BOD5 的期望值，按表 2 确定样品的稀释倍数。
5 接种液及接种稀释水
如果测定被污染的地表水及某些行业的工业废水，就需要在稀释水中加入适量的接种液，加入接种液的目的，是将能分解有机物的微生物引入到稀释水中去，这样在培养的五天中，生化过程才能顺利进行。加入接种液的稀释水，就叫接种稀释水。
接种稀释水是根据接种液（可购买接种微生物用的接种物质，接种液的配制和使用按说明书的要求操作，也可依污水自行配制）的来源不同，每升稀释水中加入适量接种液：城市生活污水和污水处理厂出水加 1～10 ml，河水或湖水加 10～100 ml，将接种稀释水存放在（ 20±1） ℃ 的环境中，当天配制当天使用。接种稀释水 pH 值为 7.2， BOD5 应小于 1.5 mg/L。
实际测定中，我们是用生活污水做接种液，这样样品就需要高倍的稀释，否则结果偏低。接种稀释水中，接種液的加入量，视其接种液的质量及被测水样的BOD5的大小而定，有时在测定BOD5标准样品时，结果偏低，很可能就是稀释水中没有加入接种液，或者加入的量不够的缘故。
6 培养温度
有机物的降解速率，是与温度成正比例的，温度相差1℃，将会引起5%左右的误差。所以不可忽视培养温度的影响，应严格控制在（20±1）℃。
7 培养瓶的体积
目前市售的培养瓶体积，一般都在310～350ml之间不等，实验中感觉到，这一体积有点偏大，更合适的体积应在220ml左右，在测试时，每一对培养瓶（当天和第五天）的体积，应尽量保持相等，这样可以减少测定误差。
8 质量保证与质量控制
8.1 空白试样
每一批样品做两个分析空白试样，稀释法空白试样的测定结果不能超过 0.5 mg/L，非稀释接种法和稀释接种法空白试样的测定结果不能超过 1.5 mg/L，否则应检查可能的污染来源。
8.2 接种液、稀释水质量的检查
每一批样品要求做一个标准样品，样品的配制方法如下：取 20 ml 葡萄糖-谷氨酸标准溶液于稀释容器中，用接种稀释水稀释至1000 ml，测定 BOD5，结果应在 180～230 mg/L 范围内，否则应检查接种液、稀释水的质量。
8.3 平行样品
每一批样品至少做一组平行样，计算相对百分偏差 RP。当 BOD5 小于 3 mg/L 时， RP 值应≤±15%；当 BOD5 为 3～100 mg/L 时， RP 值应≤±20%；当 BOD5 大于 100 mg/L 时， RP 值应≤±25%。
9 精密度和准确度
稀释法和稀释接种法的对比测定结果重现性标准偏差为 11 mg/L，再现性标准偏差为 3.7～22 mg/L。
10 结束语
用接种稀释法，测定BOD5，方法比较繁琐，时间也长，影响测定因素又多，所以要想得到一个比较满意的实验结果，在分析的整个过程中，对每一步操作都应特别注意，实验用水的质量，接种液的质量及种类、样品的前处理、稀释倍数的选择都是很重要影响因素，实际操作中必须高度重视。
参考文献
[1]环境保护部.HJ 505-2009.水质五日生化需氧量（ BOD5）的测定稀释接种法[S].北京：中国标准出版社，2009.
[2]水和废水监测分析方法编写委员会.水和废水监测分析方法（第四版）[M].北京：中国环境科学出版社，2009.
[3]杨斌，刘静，陈曜.生化需氧量（BOD5）接种液的获取方法以及加入量的研究[J].环境科学导刊，2010（1）：93-94.
[4]杨立武.BOD5测定常见影响因素及其技巧的探讨[J].科技创新与应用，2016（30）： 162.
[5]杨艳，郝燕，刘晓梅.生化需氧量（BOD5）测定影响因素[J].环境研究与监测，2011，24（2）：67-68.
作者简介：刘恋（1988-），女，理学学士，助理工程师，研究方向为环境监测。
