常见的荧光探针及其在活性氧检测中的应用
付艳华
摘 ?????要：荧光探针具有高灵敏度、高活性，在物质成分测定及反应进程监测中得到了广泛的应用。常见的荧光探针根据荧光团的不同可以分为香豆素类、氟硼荧染料、菁染料、萘酰亚胺类、荧光素和罗丹明类。活性氧（Reactive Oxygen Species， ROS）与各种细胞过程有关，主要包括转录因子的激活、基因表达、细胞增殖和死亡。由于活性氧的寿命短、活性高，且会与蛋白质、DNA、脂质膜等迅速反应，给其检测工作带来了困难。荧光探针作为一种高灵敏度的检测方法，在活性氧的检测工作中起到了重要作用。在介绍了不同荧光探针的基础上，着重对检测活性氧的荧光探针进行了详细的分类与描述。
关 ?键 ?词：活性氧;荧光探针;荧光团
中图分类号：TQ422 ??????文献标识码： A ??????文章编号： 1671-0460（2019）02-0384-04
Abstract： Fluorescent probes have high sensitivity and high activity， so they have been widely used in the monitoring of material composition and reaction process. Common fluorescence probes can be divided into coumarin， BODIPY， cyanine， naphthalimides， fluoresceins and rhodamines probes. Reactive oxygen species （ROS） are involved in various cell processes， including transcription factor activation， gene expression， cell proliferation and death. Due to the short life and high activity of reactive oxygen， it is easy to react with protein， DNA， lipid membrane and so on， so it is very difficult to detect ROS. As a high sensitive detection method， fluorescent probe plays an important role in the detection of ROS. In this paper， different fluorescent probes were introduced， especially the fluorescence probes for the detection of reactive oxygen species.
Key words： Reactive oxygen species; Fluorescent probe; Fluorophore
荧光是分子从激发单重态回到基态的过程中发射出的光，然而大多数的待测分子本身没有荧光特性，而且在化学反应的过程中，也很少能够发出荧光。但是荧光探针可以通过与待测物发生物理作用或化学变化实现荧光的变化，这使得荧光探针成为一种检测分子变化过程的工具[1]。荧光探针在探索生命活动的规律、医疗器械的开发、环境的检测等方面具有良好的应用前景[2]。
活性氧（Reactive Oxygen Species， ROS）在生物体内广泛存在，包括O2-、H2O2及HO·、1O2等，主要产生于线粒体电子传递过程。内生的活性氧在生理过程中起着重要作用[3]，它不仅是多种细胞通路的组分，同时在细胞凋亡和自噬过程中起到重要作用[4]。但是，过量的活性氧会引起氧化应激，进而导致细胞损伤和死亡。如图1所示。
常用的检测ROS的方法是利用熒光探针2，7-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFDA）标记的荧光分光光度法和共聚焦荧光显微镜动态成像技术，而共聚焦荧光显微镜动态成像技术可以观察生物中重要的ROS，同时此方法还可以定量检测某些活性氧[5，6]。这类探针大都基于氧化还原反应来显示荧光变化。氧化还原探针是一种通过氧化还原反应来改变荧光强度，使荧光“开启”或“关闭”的分子。近年来一些课题组致力于研究荧光探针在检测生物体内活性氧的应用[7， 8]。
1 ?荧光探针分类及简介
1.1 ?香豆素类荧光探针
香豆素（Coumarin）是最早被发现且易于合成的荧光类物质之一。它们的激发波长通常较短，如香豆素314（见图2），吸收波长为426 nm，因此，含有这种荧光团的分子不能较好的应用于细胞分析和成像，但是它们在在酶分析中非常重要，尤其是基于荧光共振能量转移（FRET）机制的酶抑制剂的研究很有价值。香豆素没有很强的吸收，通常我们认为≥80 000 M–1·cm–1时，是强吸收荧光团，而香豆素的吸收约为24 200 M–1·cm–1，但是它有很好的光稳定性，而且这类物质在分子内电子转移（ICT）机制中，通常有较大的斯托克斯位移，斯托克斯位移是指荧光体的激发和发射波长的差值，差值越大，自吸收现象越不易发生，能量损失越少[9]。
1.2 ?氟硼荧染料类探针
氟硼荧染料（BODIPY）是一类比较新的荧光物质，它的出现时间要追溯到1968年。它们通常有较高的荧光量子产率，以及狭窄的吸收和发射谱线。因为它们刚性结构较强，限制了吸收和发射谱线增宽的振动状态的密度，减少了激发态内转换（IC）的机率。但它的这种刚性结构也导致其斯托克斯位移非常小，即使它是非常明亮的荧光团，应用也受到了一定的限制。氟硼荧染料主要应用在光诱导电子转移（PET）和荧光共振能量转移（FRET）机制中，且有多个修饰位点（见图3），所以有许多商品化的衍生物可以直接和生物分子结合。
例如：氟硼荧染料的衍生物和2，4-二硝基苯磺酰氯结合能够区分谷胱氨肽和其他氨基酸[10]。
1.3 ?菁染料荧光探针
菁染料荧光探针有非常高的吸光系数，是目前已知最亮的荧光团[11]，如Cy3，Cy5（见图4）。菁染料荧光素是最早可发射红外和近红外波长的染料，曾得到广泛应用。然而，该类荧光探针存在两个很大的缺点：首先，菁染料荧光探针极易被氧化，除了容易发生光氧化，该类探针（如Cy5的衍生物）还极易与O2 及臭氧发生反应;其次，菁染料荧光探针的荧光量子产率通常比较低（?≤0.28）。这两方面的限制使得该类探针不适用于长时间监测[12]。
1.4 ?萘酰亚胺类荧光探针
我们通常认为萘酰亚胺类和香豆素类一样，是具有短波长、较大的斯托克斯位移的荧光分子[13]，如Lucifer Yellow CH（见图5）吸收波长为425 nm，发射波长为528 nm。这类物质的亮度比香豆素类强、易合成和修饰、荧光特性稳定、能很好的抵抗光漂白。
尽管它现在有较长激发波长的衍生物，发射波长也在红外或者近红外波长范围，但这些衍生物目前尚未得到较好应用。
1.5 ?荧光素和罗丹明荧光探针
荧光素和罗丹明的合成可以追溯到19世纪晚期，其中最具有代表性是荧光素和罗丹明B（见图6）。该类荧光探针的特点主要是荧光强度较强，相关衍生物的发射波长可以达到红外或近红外区域，但其也存在一定的缺陷。首先，荧光素和罗丹明衍生物的光稳定性差，1 h的光照辐射就会导致其发生明显的光漂白;其次，该类探针的合成收率低下，且纯化困难。尽管如此，由于细胞渗透性、细胞定位和细胞内聚集都非常依赖于这类荧光团的特定结构，且它们有较大的斯托克斯位移，该类探针被广泛用于化学、生化、生物以及医学领域[14， 15]。
2 ?各类荧光探针在活性氧检测研究中的应用
2.1 ?香豆素类荧光探针的应用
硝酰基（HNO）呈现弱酸性（pKa = 11.4），是一种与心脏保护有关的活性氧分子。虽然HNO的去质子化过程（生成NO-）异常缓慢，但是NO-一旦生成，会与氧气迅速反应形成过氧亚硝基（OONO-）。对于该反应过程，之前一直没有明确的研究方法。Adam Sikora[16] 等利用香豆素类荧光探针在水溶液中对HNO进行定量检测，为HNO和分子氧的反应过程以及过氧亚硝基的形成提供了明确的依据。他们报道的7-硼酸香豆素a（见图7）在磷酸盐缓冲液中无荧光，在OONO-的加成，O-O键的异裂之后，产生了荧光物质7-羟基香豆素b（见图7）这一过程可以量化检测过氧亚硝基。
2.2 ?氟硼荧染料类探针的应用
一氧化氮（NO）是一种常见的生物信使分子，并在各种生理调节过程中发挥着积极的作用。Wei Guo[17]等利用氟硼荧染料类探针，首次基于PET机制利用富电子芳香二次胺的亚硝化反应，构造出了反应快，选择性高，灵敏度高荧光探针c1，c2（见图8）对NO进行检测。在探针c1、c2中，N-苄基-4-羟基苯胺基是供电子基团，而BODIPY的8位是缺电子结构，由此带来的电子转移导致N-苄基-4-羟基苯胺基的电子云密度降低。基于以上PET机制，c1、c2发生荧光淬灭。但是当c1、c2与NO反应后生成，N-苄基-4-羟基苯胺基上连接NO之后，电子云密度降低，不再发生荧光淬灭，d1、d2产生非常明显的绿色荧光。
2.3 ?菁染料荧光探针的应用
过氧亚硝基（ONOO-）在生物体信号转导中起到重要作用，对体内平衡调节和氧化损伤的研究有重要意义。菁染料荧光探针具有独特的生物氧化-还原循环结构。Keli Han[18]等基于氧化还原机制，利用菁染料荧光探针e（见图9）对ONOO-进行了可逆监测。硒（Se）通常作为抗氧化酶的活性位点，在这一探针中可以调节ONOO-水平，同时谷胱甘肽（GSH）通过可逆的过程来还原ONOO-，即该探针中含有的有機硒可用于可逆的过氧亚硝酸盐的检测。该探针基于PET机制导致荧光淬灭，但在ONOO-氧化作用下，产生SeO这一吸电子基团，基于SeO的推拉电子效应（ICT），荧光光谱发生蓝移，荧光强度增强了23.3倍。
2.4 ?萘酰亚胺类荧光探针的应用
Peng等[19]报道了一种基于非氧化还原机制的检测氧自由基的比率荧光探针g（图10）。探针由二苯基膦酸盐基（活性氧的触发点），三苯基膦（使探针到达线粒体），氨基甲酸酯与1、8-萘酰亚胺相连（吸电子基团）组成。这一探针的荧光变化是基于ICT效应的变化来改变的。在探针g中加入氧自由基后，产生绿色荧光产物h（见图10），在供电子基团不变的情况下，产物h中吸电子效应较探针g减弱，导致推-拉电子效应（ICT效应）增强，荧光波长红移，最大吸收波长从375 nm移至431 nm，同时荧光发射波长从475 nm红移至540 nm，且荧光强度增强了18倍。
2.5 ?荧光素和罗丹明荧光探针的应用
杨丹课题组[20]报道了基于氧化还原机制的荧光素类探针i（见图11），该探针可以定量检测HOCl，且特异性强，灵敏度高。该探针中由于邻氯取代基的作用，将苯酚的pKa从10.0（不含氯取代）降低至6.79，氯代苯酚的电子云密度增高，通过PET机制淬灭荧光。探针中富电子的氯代苯酚亲核性很强，与HOCl反应，生成氧化产物j（见图11）。
同时氯代苯酚氧化脱去，PET机制消失，荧光增强约358倍。
3 ?结束语
过去20年中，基于不同的机制和荧光团，荧光探针在活性氧检测方面的开发和应用取得很大的进展。但是还有许多问题亟待解决，比如光稳定性差，选择性低等。构建更为快捷、准确、方便的检测探针，并将其应用于生物、环境、医疗、食品各个领域中，将是我国对荧光探针研究和探索的重要方向。
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