喷气燃料中微生物污染及检测方法概述
牛明明 熊 云 孙新枫
摘 ?????要：微生物污染会降低燃料品质、影响燃料供给系统正常工作、增加燃料腐蚀性，是影响燃料储存和飞机飞行安全的重要因素。从喷气燃料中的特征微生物、微生物污染的危害和喷气燃料中微生物检测方法三个方面综述了近几年喷气燃料中微生物污染问题研究进展，分析了目前仍然存在的问题，提出了下步研究的重点方向。
关 ?键 ?词：喷气燃料;微生物污染;危害;检测方法
中图分类号：TE626 ??????文献标识码： A ??????文章编号： 1671-0460（2019）02-0410-05
Abstract： Microbial contamination is an important factor affecting fuel storage and aircraft flight safety， because the microbial contamination can reduce the quality of fuel， affect the normal operation of the fuel system and increase the fuel corrosiveness. Based on the overview from three aspects， including the characteristic microbes in jet fuel， the hazards of microbiological contamination and the detection methods for microbes in jet fuels， existed problems of the detection methods were analyzed， and some advice on the next research was put forward.
Key words： Jet fuel; Microbial contamination; Problems; Detection methods
据统计，50%的航空发动机故障是由燃料的洁净性不良引起的[1]。微生物是影响燃料洁净性的一个重要因素[2，3]，对喷气燃料的储存和飞机飞行安全有重大影响。自1930年以来，人们逐渐认识到燃料中微生物生长繁殖所带来的一系列危害，喷气燃料的微生物污染问题开始受到关注[4]。1996年，微生物污染导致我国某机场数十台发动机燃油泵堵塞，造成发动机燃油系统故障，更换发动机两月后，同样的故障依然出现，导致机场所有飞机停飞[5];2007年，国航西南公司的A340飞机油量传感器故障，疑为微生物污染引起[6]。依据IATA的指导意见，从2009年下半年开始，我国对北京、天津、上海虹桥和广州四个机场油料公司，进行微生物污染监控，确实发现了微生物污染问题的存在[7]。
1 ?喷气燃料中的特征微生物
李鹏认为[8]微生物进入喷气燃料可能有两个途径，部分是大气中的微生物通过油罐呼吸等方式进入喷气燃料并进行繁殖生长，部分可能是油藏内源微生物。据报道[9]，有些微生物是在油藏形成过程中带入沉积环境的微生物，它们在生长发育过程中细胞质脱水浓缩，形成休眠状态的微生物，即芽孢。芽孢对热、干燥、辐射及消毒剂具有很强的抵抗能力[10]，因此能够抵抗石油炼制过程的高温，然后进入燃料，并在适宜的条件下吸水膨胀重新发育成有繁殖能力的微生物。
水分、碳源、氮源和無机盐是微生物生长必须的营养要素[11]。喷气燃料在储运和使用过程中，雨露冰霜侵入、容器中水蒸气凝结、燃料所处环境温度变化以及人员操作不规范等原因，往往会导致一些水分的混入。这些水分通常以游离水、溶解水状态存在。游离水是悬浮在油中的水粒或沉淀在容器底部的水分;溶解水是由于燃料中烃类微弱的溶水性而溶解到燃料中的水分。燃料中这些微量的水分便能满足微生物生长所需，尤其是储油容器底部、输油管路下凹部位沉降的水层更是如此。喷气燃料主要成分是烷烃、环烷烃和芳香烃等烃类化合物，均能被微生物当作碳源进行代谢。所需氮源主要来自喷气燃料中添加剂以及供油系统材料，如腈橡胶、聚氨酯类物质;无机盐可能来自燃料本身[12， 13]。
喷气燃料中微生物种类繁多，而且受地域等因素影响，喷气燃料中微生物的种类也有所区别。杨浩等[14，15]从我国西南不同区域的5个油库取的5个油样中，检测到的微生物分属11个门、44个纲、90个目、151个科、217个属。郭玲玲等[16]在培养基上对喷气燃料油样中微生物进行培养、鉴定。结果显示，每毫升罐底油样、沉淀罐油样在琼脂培养基上分别检测到3 688个、4 957个菌落，仅通过形态学就鉴定出8种细菌、6种真菌，还不包括生长缓慢等原因导致未鉴定出的微生物。
虽然喷气燃料中包含有多种微生物，但是不同种类微生物在喷气燃料中丰度不同。有些微生物的丰度相对较高，且普遍存在于喷气燃料中，这类微生物即为喷气燃料的特征微生物。Ferrari，M.D等[17]在1990-1996间收集了350个喷气燃料油样并分析微生物污染情况，发现污染微生物主要有油相中的枝孢菌（Cladosporium）、曲霉菌（Aspergillus）和水相中的假单胞菌（Pseudomonas spp）、硫酸盐还原菌（Sulphate reducing bacteria）等。袁祥波等[18]在不同油样中均培养出了一种真菌，并将其鉴定为枝孢霉属Amorphotheca resinae真菌。杨浩等[19]在不同区域取得的6个油样中均培养出了枝孢霉菌（Amorphotheca resinae）、Khuskia oryzae，帚状曲霉（Aspergillus penicillioides）以及局限青霉（Penicillium restrictum）。
2 ?喷气燃料中微生物的主要危害
微生物在喷气燃料中生长繁殖会消耗燃料的重要成分，影响燃料使用性能;其代谢产物会腐蚀燃料储供系统、堵塞用油系统精密器件，给飞行安全带来潜在的灾难性后果。
2.1 ?降低喷气燃料品质
表面活性物质是真菌和细菌代谢的副产物，不仅会降低燃料的表面张力，增强油水乳化现象，使油中的水分不易分离出去，而且还会使燃料中的一些细微杂质在过滤器上聚集，影响过滤效果，进而影响燃料的低温性和洁净性[20-22]。微生物在生长过程中，会利用燃料中的部分添加剂作为营养成分，而随着添加剂的消耗，燃料的品质也会有所下降[23]。微生物在利用喷气燃料中的烃类进行代谢过程中，会降解燃料成分，引起燃料理化指标的变化。崔艳雨等[7]从受微生物污染的储罐不同位置取样，在实验室富集培养，按照标准规定的试验方法对喷气燃料相关指标进行检测，并将结果与未受污染微生物油样进行对比，发现微生物污染对燃料外观、总酸值、固体颗粒污染物影响较大，但是对密度、闪点、冰点、水反应、馏程、铜片腐蚀、粘度影响不大。熊云、龙泉芝等[24，25]考察了喷气燃料特征真菌Amorphotheca resinae对喷气燃料理化性能的影响，也得出了相类似的结果，即喷气燃料的外观、酸值、颗粒度、水分离指数等指标受影响较大，而密度、闪点、冰点、水反应等受影响较小。
2.2 ?影响燃料供给系统
微生物繁殖会堵塞燃油过滤器、金属过滤网和其他细小孔隙，严重影响供油，并使油量表不准确，影响飞机正常工作[2]。微生物繁殖造成燃料系统堵塞可能有两个原因。一方面促使生成悬浮物。熊云、袁祥波等[26，27]认为，微生物菌丝相互缠绕形成可见的悬浮物，混入油料中的纤维能将菌丝悬浮物勾连到一起形成更大悬浮物，并不断吸附油料中的尘土等小颗粒物质而成长，进而引起过滤器堵塞等问题。另一方面可以形成生物膜[9]。微生物在生长过程中，会附着在滤网表面形成胞外聚合体，即生物膜，并引起诸如滤网堵塞等一系列问题。含菌油料在流动过程中接触滤网等物体时，滤网表面会迅速形成有机分子的条件膜，并促使微生物附着在滤网表面，然后微生物开始合成蛋白质，产生胞外聚合物，使微生物固定在滤网表面。微生物分泌的胞外聚合物会吸附油料中的微粒物质和其他微生物，使滤网上的生物膜不断发育增长，直至堵塞滤网。此外，由于细胞含水较多，因此微生物是电导体。随着微生物的繁殖，燃料的介电常数会发生变化，造成电容式测量传感器精度下降，甚至发生短路和失效，影响燃料的计量系统正常工作[11， 28]。
2.3 ?增加燃料的腐蚀性
微生物能在喷气燃料中繁殖能代谢产生二氧化碳、醇、脂、有机酸等物质，有的微生物还能将燃料中的硫化物转化为硫、硫化氢等活性含硫物质（如硫酸盐还原菌，Sulfate-Reducing Bacteria，简称SRB），使燃料pH值下降，腐蚀性能增加[2，3]。对于微生物引起腐蚀问题，比较统一的观点是由微生物代谢产生的活性硫化物导致的。我国学者关于微生物代谢产生活性硫化物的问题，主要有以下几种观点[29，30]：一是微生物在油水界面处、罐底沉积物中繁殖，将喷气燃料中某些非活性硫化物转化为活性硫化物，引起喷气燃料腐蚀性[31]。二是33号添加剂含有的硫化物不会使燃料及底层水pH降低，起主要作用的是氧化硫硫杆菌。氧化硫硫杆菌生长繁殖产生硫酸，硫酸与水层硫化物作用生成硫化氢，并导致喷气燃料出现腐蚀[32]。三是SRB或硫氧化菌利用罐底水中硫化物产生硫化氢，硫化氢扩散进入油相导致喷气燃料出现腐蚀性。赵升红等建立了相应传质模式[33]。
杨浩、郭玲玲等[23，30]认为SRB是对燃料系統危害较大的一种微生物。主要生长在喷气燃料下面的水相中，能够以硫酸盐为电子受体，以有机物和氢为能源和电子供体进行厌氧呼吸。其代谢产物H2S能微量溶解在水和喷气燃料中，致使燃料的腐蚀性大大增加。
3 ?喷气燃料中微生物的检测
喷气燃料中微生物检测是加强油料使用管理、判断燃料污染情况、确保飞行安全的重要手段，鉴别特征微生物种类是研究微生物危害机理、针对性采取防范措施和高效灭菌的前提。
3.1 ?传统平板培养方法
平板培养法是根据微生物生长所需要的营养物质、水分、温度、pH等条件，在培养基上人工培养样品中微生物的方法[11，34]。微生物经过一段时间繁殖生长后，便会形成肉眼可见的各有特征的菌落。因此可以通过平板培养法计算活菌数量，检验微生物污染程度，鉴定一些常见的微生物类型。
平板培养法简单易行，不需要昂贵复杂的专业设备，培养成本较低。但是该方法操作周期长，不能实现实时监控;对操作人员的要求较高，全程不能受其他微生物污染，需要操作人员具有一定的微生物实验基础知识;实验结果具有一定的主观性，对实验者依赖较高，不同的人操作可能会得到不同的结果;在样品中含量较少的微生物，很难通过平板培养法分离得到。因此，在油库推广使用具有一定的难度。
3.2 ?国际民航组织推荐的方法
国际航空运输协会推荐了五种检测微生物的方法和设备，分别为英国ECHA 微生物学有限公司的MicrobMonitor2法、芬兰奥林诊断公司的Easicult Combi法、英国生物学分生孢子有限公司的FUELSTATTM resinae法、德国默克集团的HY-LiTE Jet A1燃料检验法以及日本San-AI-Oil生产的San-Ai Biochecker FC法[20]。其中前三种方法通过估计给定体积的燃料或水在营养胶中生成的可见微生物菌群数量来定量评定污染等级;FUELSTATTM resinae法是免疫测定法，通过检测样品中微生物活性测量其数量，其中活性是根据样品中微生物净重测定的;HY-LiTE Jet A1燃料检验法通过测量样品中ATP总量检测微生物数量，其中ATP总量与样品中新陈代谢活性有关[20]。
3.3 ?建立在PCR基础上的16S或18SrRNA测序
核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA）存在于所有生物的细胞中，具有重要的生理功能，并且在细胞中相对稳定，包含有反映物种亲缘关系的保守序列和反映物种间差异的突变序列[35]。因此依据rRNA保守序列设计一引物，对rRNA进行PCR扩增，然后测定其序列，就可以对其进行物种鉴定。
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是指在引物存在的条件下，以样品DNA为模板，在DNA聚合酶的催化作用下，经过高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤，对特定DNA序列进行体外快速扩增的技术，故又称为基因的体外扩增法[36，37]。该方法具有特异性高、反应速度快的特点，可在1～2 h内重复25～30个循环，样品DNA可扩增106～107倍[34]。基于PCR的16SrRNA或18SrRNA测序技术不依赖微生物的培养分离，可以检测不能培养或生长缓慢的微生物;具有检测速度快、灵敏度高、特异性强、操作简便等特点，在微生物鉴定领域有广泛的应用。熊云、袁祥波等[27]通过PCR扩增、18S rDNA测序，鉴定了喷气燃料中的特征真菌为枝孢霉属（Amorphotheca resinae真菌）;对油样中悬浮物和真菌DNA进行PCR扩增、凝胶电泳检测，认为油样悬浮物中含有真菌，探讨了喷气燃料中悬浮物的形成机理。之后，该课题组通过该技术确定了喷气燃料中的另外三种特征真菌[15，19]，即Khuskia oryzae、帚状曲霉（Aspergillus penicillioides）以及局限青霉（Penicillium restrictum）。
虽然RNA测序技术有优良的特征，但在应用中也存在一些不足，譬如检测过程需要昂贵的专业设备;PCR过程要求比较苛刻的实验条件，操作过程需在无菌环境进行、试样不能被其他微生物污染;PCR扩增过程容易交叉扩增，使结果出现假阳性。因此该方法比较适合在实验室实施，难以在油库、场站等大面积推广实施。
3.4 ?LAMP—LFD检测技术
环介导恒温扩增（Loop-mediated isothermal amplification ，简称LAMP）是在恒温条件下，利用四条特殊设计的引物（两条内引物、两条外引物）和具有链置换活性的Bst DNA 聚合酶，快速、特异、高效的体外扩增DNA的技术[38]。在酶的作用下，内外引物交替作用形成哑铃状结构，然后在酶和内引物的作用下，以哑铃状结构为基础不断复制目标DNA。LAMP扩增方法具有灵敏度高、特异性强、扩增速度快、设备简单等诸多优点，是一种高效的扩增方法。
2008年，Kiatpathomchai等[39]将LAMP与横向流动试纸条快速检测技术（LFD）相结合，使LAMP扩增产物的检测更加简洁、直观、可靠。该方法将扩增产物用生物素标记，再与FITC（异硫氰酸荧光素）标记的特异探针进行杂交，然后将试纸条垂直放入含杂交产物的检测液中或吸取少量杂交产物滴加到试纸条上。该复合物经层析膜进行扩散，扩散到检测线时生物素标记的扩增产物被生物素配体捕捉，试纸条上会出现有颜色的肉眼可以直接观察的检测线，而未被捕捉的复合物继续扩散，扩散到质控线时被特异性抗体捕捉，并在试纸条上形成可观察的质控线[22，40]。LAMP-LFD简便易行，不要求昂贵的专用仪器，只需要水浴锅或加热器等简单的恒温设备即可（60～65 ℃）;对操作者要求不高，不需要专业的生物学知识;实验结果客观易判，对操作者的经验、对颜色类实验现象的敏感度等主观因素依赖较少。目前，LAMP-LFD已在病毒、细菌、真菌快速检测等领域得到了廣泛应用。Kiatpathomchai等[39]将逆转录环介导等温扩增法（RT-LAMP）与横向流量试纸条技术（LFD）相结合，用目测的方法简单、快速的检测出了虾桃粒病毒（ TSV）特异性的扩增产物;对将RT-LAMP-LFD的灵敏度与RT-LAMP-凝胶电泳进行了对比实验，结果显示，前者灵敏度比后者高了100倍，而比巢式PCR-凝胶电泳高了10倍。熊云、和倩倩等[22，41]以枝孢霉菌（A.resinae）18S rRNA为模板基因，设计了四组引物，通过LAMP-LFD实验筛选了效率最高的引物组、优化了实验条件，建立了检测检测喷气燃料特征真菌A.resinae的快速实验方法，并对比了LAMP-LFD与PCR-凝胶电泳两种方法的灵敏度和特异性，结果显示前者灵敏度更高、特异性更强。随后该课题组[15]建立了喷气燃料中另外三种特征真菌帚状曲霉（Aspergillus penicillioides）、局限青霉（Penicillium restrictum）以及Khuskia oryzae的LAMP-LFD快速检测方法，并与PCR-凝胶电泳法进行了灵敏度、特异性和重复性对比实验，得出了相同的结论。
LAMP-LFD技术作为一种新颖的微生物检测方法，不仅克服了PCR法扩增过程中需要温度循环、扩增完成后需要电泳检测、需要昂贵的操作仪器等弊端，而且具有灵敏度高、特异性强、扩增速度快、结果易于检测、反应时间短、检测成本低等无可比拟的优点，因此具有较为广泛的应用，是喷气燃料储存、使用过程中实时监控微生物污染情况的理想方法。但是该方法也有一定的不足，譬如引物设计复杂，有较高的特异性要求，而且高效引物筛选也需要大量的实验;扩增完成后，检测过程不是在密闭容器进行，产物可能会扩散到环境中，并导致实验结果假阳性。
3.5 ?ATP发光法
三磷酸腺苷（ATP）存在于活细胞中，是生物体中最重要的能量载体，它作为“能量货币”参与细胞新陈代谢过程中能量的储存、转移与释放。由于所有生物细胞中都含有恒量的ATP，细胞裂解后会将ATP释放出来。在ATP和镁离子的环境下，荧光素酶可将虫荧光素氧化成带电激发状态。激发态的分子释放一光子后回到基态，反应过程如下式所示[11]：
蟲荧光素+荧光素酶+ATP
虫荧光素—荧光素酶—AMP+ppi+O2
氧化荧光素—荧光素酶—AMP+H2O
氧化荧光素+荧光素酶+AMP+hv（560 nm）
A.Thore等[42]通过实验表明，微生物与ATP浓度之间具有相关性，而通过标准曲线可得ATP浓度与荧光值之间的相关性，故微生物与荧光之之间具有相关性。事实上，当ATP含量在一定范围时，活细胞对数值与ATP发光值的对数值之间存在线性关系[43，44]，因而可以通过测定ATP荧光值计算微生物数量。丛苑等[44]分别通过平板计数法和ATP发光法测定了玉米中霉菌数量，验证了两种方法所得结果之间的相关性，说明了通过ATP发光法测定霉菌数量的可靠性，还筛选了有效的霉菌ATP提取方法和提取条件、建立了检测玉米中霉菌数量的ATP快速检测方法。邱颖等[45]分别用ATP发光法、平板计数法测定了水中细菌的ATP发光值和细菌总数，然后用统计学方法分析两者对数的相关性。结果显示，当水中细菌数在一定范围时，ATP发光值对数与细菌总数对数之间呈良好的线性关系。崔露露[46]在不同OD600nm下，分别对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌进行平板计数、测定发光强度，结果显示细菌数与发光强度以及两者对数值之间均具有良好的线性关系，再次验证了ATP发光发的可靠性;优化了测定条件，建立了天然水中细菌总数的ATP快速测定方法。
ATP发光法不仅具有操作简便、快速的特点，而且测定范围较广，可以一次检测出全部活体微生物的含量;ATP荧光法是一种即时操作方法，测定的微生物含量即为取样时的含量，没有时限延迟，可以实现飞机油箱、储油罐的在线检测。但是该方法也存在灵敏度不够高、反应体系最佳条件难以确定、结果易受游离ATP干扰以及不能用作微生物种属鉴定等弊端[47]。然而在喷气燃料微生物污染程度的监控中，该方法依然是比较有效的检测手段，只要严格按照规程操作，足以满足监控需求。熊云、李泽振等结合我国喷气燃料实际情况，建立了用ATP发光法检测喷气燃料中微生物污染程度的方法，筛选了高效的提取液、裂解液，优化了检测设备。
4 ?展 望
目前，喷气燃料微生物污染问题已逐渐引起人们的重视。但由于喷气燃料国家标准没有对微生物做出规定，日常化验中没有微生物检测项目，没有公认的微生物污染等级标准和检测标准，在储存、使用过程中并没有对微生物进行监控，这增加了燃料被微生物污染的风险和飞行安全隐患。所以下一步应重点研究以下几个方面：
（1）量化喷气燃料中微生物污染等级标准，明确处于不同污染等级燃料的处理措施;
（2）制定微生物检测标准，规范实验操作程序;
（3）优化实验设备，提高实验效率、降低实验成本。
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