液相色谱·三重四极杆串联质谱法测定昆虫对茚虫威活化代谢活性的差异
高希武等
摘要：采用液相色谱三重四极杆串联质谱，建立了测定昆虫对茚虫威活化代谢（N脱甲氧羰基反应，产物为DCJW）活性的新方法。按本方法制备样品后30 h内，产物DCJW的化学稳定性较好，5次重复测定的相对标准偏差（RSD）为2.1%。本方法的检出限为0.01 pg，定量限为0.1 pg；DCJW纯乙腈溶液、小菜蛾酶促反应样品连续进样、5次独立酶促反应样品分别进样， 3组样品独立测定的RSD分别为0.7%， 1.1%， 2.7%； 3种DCJW添加水平（440，880和2200 pg）的回收率为96.1%～102.9%，RSD为4.8%～9.4%；DCJW在46～2310 pg范围内线性关系良好。本方法灵敏度高，操作方便，适用于昆虫代谢酶系对茚虫威的活化代谢活性分析。应用本方法比较了小菜蛾阿维菌素抗性品系与敏感品系对茚虫威 N脱甲氧羰基代谢活性差异，结果表明，小菜蛾抗性品系对茚虫威N脱甲氧羰基活性是敏感品系的3.43倍，初步推断小菜蛾对杀虫剂阿维菌素和茚虫威可能存在负交互抗性。
关键词：液相色谱三重四极杆串联质谱； 茚虫威； 活化代谢； 小菜蛾
1引言
昆虫体内介导杀虫剂直接代谢的酶系主要包括细胞色素P450酶系[1]，水解酶系[2]，以及谷胱甘肽S转移酶系[3]等。昆虫代谢酶系催化的杀虫剂代谢具有重要的毒理学意义，主要表现为解毒代谢与活化代谢，或表现为解毒代谢与活化代谢的某种平衡，其代谢活性高低直接影响着杀虫剂在昆虫体内的存在形式、作用机制、生物活性和抗药性水平等[4]。在昆虫毒理学研究中，特别是在杀虫剂抗药性生化机制研究中，为了表征昆虫酶系的代谢活性在杀虫剂代谢抗性机制中的作用，常利用经典的光谱方法（紫外可见光度法或荧光光度法）测定昆虫对多种模式底物或杀虫剂类似物的代谢活性来表示[5]。近年来，建立了一些相应的色谱或色谱质谱联用分析方法[6～9]。然而，利用色谱及色谱质谱联用技术表征昆虫对杀虫剂直接代谢活性的报道却很少[5]。因为应用模式底物（无论一种还是多种底物）表征昆虫对杀虫剂的代谢活性是间接的，而测定昆虫对杀虫剂本身的代谢活性则更有说服力[1]，所以开发合适的分析方法，直接测定昆虫对杀虫剂的代谢能力，将在昆虫毒理学研究中有广泛的应用。
茚虫威（Indoxacarb， DPXJW062）是美国杜邦公司开发的新型噁二嗪类杀虫剂，几乎对所有鳞翅目害虫都有防效，其作用机理是茚虫威在鳞翅目昆虫的脂肪体，特别是中肠内活化代谢为N脱甲氧羰基代谢产物（Ndecarbomethoxyllated indoxacarb， DCJW），DCJW阻断害虫神经细胞中Na+通道，使神经细胞丧失功能而导致害虫死亡[10，11]。目前，尚无测定昆虫对茚虫威活化代谢活性方法的报道。本实验建立了高效液相色谱三重四极杆串联质谱联用的多反应监测（MRM）分析方法，用于准确测定昆虫对茚虫威的水解活化代谢活性（图1）[10，11]。本方法选用棉铃虫中肠作为酶液，进行MRM分析参数优化，分析方法的建立及确认是通过小菜蛾酶液的代谢反应进行的。MRM分析中，以m/z 267.0为定量离子，m/z 207.0， 150.0为定性离子，通过定量分析产物DCJW的生成量，表征茚虫威的水解活化代谢活性，用于分析小菜蛾阿维菌素抗性品系与敏感品系对茚虫威活化代谢活性的差异。
3.5小菜蛾阿维菌素抗性品系与敏感品系的茚虫威N脱甲氧羰基活性比较
小菜蛾抗性与敏感品系催化茚虫威的N脱甲氧羰基反应同时进行，结果表明， 小菜蛾阿维菌素抗性品系的茚虫威N脱甲氧羰基酶活性与敏感品系相比显著增强，其活性是敏感品系的3.43倍（表2）。这种对茚虫威活化代谢的增强，初步表明，小菜蛾阿维菌素抗性品系与敏感品系相比，可能对茚虫威更敏感，即对阿维菌素和茚虫威可能存在负交互抗性，该结果需要通过小菜蛾抗性与敏感品系对茚虫威的生物测定来验证。澳大利亚对菊酯类杀虫剂产生抗性的棉铃虫对杀虫剂茚虫威更敏感，因而存在负交互抗性[14]。尽管茚虫威在鳞翅目昆虫体内易发生活化代谢，但由于多种抗性机制的存在，昆虫仍然会对茚虫威产生不同程度的抗性[15～17]，因此研究昆虫对茚虫威的活化代谢活性具有重要的毒理学意义。
3.434结论
本实验建立了液相色谱三重四极杆串联质谱MRM模式表征昆虫对茚虫威的N脱甲氧羰基代谢活性的新方法，操作方便，省去了常用的有机溶剂萃取、浓缩、定容等步骤。本方法结合了液相色谱的高效分离、三重四极杆串联质谱MRM分析模式的强定性和高灵敏度的特点，适用于昆虫对茚虫威水解活化代谢活性的直接分析，将应用于茚虫威相关的昆虫毒理学研究中。
References
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10Wing K D， Schnee M E， Sacher M， Connair M， Scott M T， Rhodes B G， Ryan D L， Li Y， Gaddamidi V， Brown A M. Archives of Insect Biochemistry and Physiology， 1998， 37（1）： 91-103
11Wing K D， Sacher M， Kagaya Y， Tsurubuchi Y， Mulderig L， Connair M， Schnee M. Crop Protection， 2000， 19： 537-545
12Bradford M M. Anal. Biochem.， 1976， 72： 248-254
13Bearden J C， Jr. Biochim. Biophys. Acta， Protein Struct.， 1978， 533（2）： 525-529
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3.5小菜蛾阿维菌素抗性品系与敏感品系的茚虫威N脱甲氧羰基活性比较
小菜蛾抗性与敏感品系催化茚虫威的N脱甲氧羰基反应同时进行，结果表明， 小菜蛾阿维菌素抗性品系的茚虫威N脱甲氧羰基酶活性与敏感品系相比显著增强，其活性是敏感品系的3.43倍（表2）。这种对茚虫威活化代谢的增强，初步表明，小菜蛾阿维菌素抗性品系与敏感品系相比，可能对茚虫威更敏感，即对阿维菌素和茚虫威可能存在负交互抗性，该结果需要通过小菜蛾抗性与敏感品系对茚虫威的生物测定来验证。澳大利亚对菊酯类杀虫剂产生抗性的棉铃虫对杀虫剂茚虫威更敏感，因而存在负交互抗性[14]。尽管茚虫威在鳞翅目昆虫体内易发生活化代谢，但由于多种抗性机制的存在，昆虫仍然会对茚虫威产生不同程度的抗性[15～17]，因此研究昆虫对茚虫威的活化代谢活性具有重要的毒理学意义。
3.434结论
本实验建立了液相色谱三重四极杆串联质谱MRM模式表征昆虫对茚虫威的N脱甲氧羰基代谢活性的新方法，操作方便，省去了常用的有机溶剂萃取、浓缩、定容等步骤。本方法结合了液相色谱的高效分离、三重四极杆串联质谱MRM分析模式的强定性和高灵敏度的特点，适用于昆虫对茚虫威水解活化代谢活性的直接分析，将应用于茚虫威相关的昆虫毒理学研究中。
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