高效液相色谱 串联质谱法测定牛羊组织中苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药多残留
李帅鹏+黄显会+王伟+严常燕+孔祥凯??
摘 要 建立了高效液相色谱 串联质谱法同时测定牛、羊组织中硝碘酚腈、氯羟柳胺、氯氰碘柳胺、碘醚柳胺4种苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药的多残留检测方法。样品用乙腈 丙酮（60∶40，V/V）（肌肉、肝脏和肾脏组织）或1%三乙胺乙腈（脂肪组织）超声提取，MAX阴离子固相萃取柱净化，液相色谱分离，采用多反应监测负离子模式对4种药物同时进行定性定量分析，在1～100 μg/L 范围内，4种药物与其对应峰面积的线性关系良好，相关系数均大于0.99。在牛、羊组织中的检出限（LOD）均为1 μg/kg，定量限（LOQ）均为2.5 μg/kg。 在LOQ、0.5倍最高残留限量（MRL）、MRL、2倍MRL添加水平下，4 种药物的平均回收率在71%～112%之间，日内相对标准偏差（RSD）在1.1%～14.0%之间，日间RSD在6.4%～14.7%之间。采用本方法对市场上动物可食性组织进行抽样检测，共抽检40份样品，2份样品检测出苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药残留。
关键词 苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药； 牛羊组织； 多残留； 高效液相色谱 串联质谱
1 引 言
氯羟柳胺（OXY）、硝碘酚腈（NIT）、氯氰碘柳胺（CLO）、碘醚柳胺（RAF）是一类苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药，作用机理是通过阻断肝片吸虫的氧化磷酸化过程，使虫体麻痹、死亡，用于驱杀牛、羊的肝片吸虫、蛔虫和绦虫，对血毛线虫、巨片吸虫和羊蝇蛆亦有较好作用。随着国内驱虫药的广泛应用和研究，发现碘醚柳胺有明显胚胎毒性[1]； 氯氰碘柳胺对肝、肾具有一定的毒、副作用[2]； 高剂量硝碘酚腈可引起心脏、神经、肌肉和呼吸的损害[3]。欧洲医药评价署、澳大利亚以及食品法典委员会均已制定了上述药物的最大残留限量（Maximum residue limit，MRL），残留标志物均为原形药物，残留监测的动物是牛羊。靶组织MRL分别如下：硝碘酚腈：牛、羊，肌肉400 μg/kg、脂肪200 μg/kg、肝20 μg/kg、肾400 μg/kg。碘醚柳胺：牛，肌肉30 μg/kg、脂肪30 μg/kg、肝10 μg/kg、肾40 μg/kg； 羊，肌肉100 μg/kg、脂肪250 μg/kg、肝150 μg/kg、肾150 μg/kg。氯氰碘柳胺：牛，肌肉1000 μg/kg、脂肪3000 μg/kg、肝1000 μg/kg、肾3000 μg/kg； 羊，肌肉1500 μg/kg、脂肪2000 μg/kg、肝1500 μg/kg、肾5000 μg/kg。氯羟柳胺：牛、绵羊，肌肉20 μg/kg、脂肪20 μg/kg、肝500 μg/kg、肾100 μg/kg。我国农业部（2003）235号公告[4]已经颁布硝碘酚腈、碘醚柳胺、氯氰碘柳胺的最高残留限量，氯羟柳胺的最高残留限量正在制定中。
目前，关于苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药在组织中残留的检测方法主要有高效液相色谱与紫外检测器[5～8]、荧光检测器和质谱检测器联用[9，10]、高效液相色谱 串联质谱法[11～16]。国内仅报道高效液相色谱 串联质谱法[9]检测氯氰碘柳胺在牛组织和牛奶中残留的研究，国外对于苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药在组织中残留分析方法的报道主要局限于某种组织或者是单残留和两种药物的残留检测方法，尚未报道关于4种苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药在牛、羊组织中的多残留检测方法。本研究采用HPLC MS/MS分析牛、羊组织中4种苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药的多残留，方法前处理简便易行，灵敏度高，精密度及重复性好，适用于牛、羊组织中苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药的多残留检测。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
Agilent 1200型液相色谱仪（美国安捷伦公司）； API4000电喷雾 串联四极杆质谱仪，配Analyst 4.1.5 软件（美国应用生物系统公司）； C18 色谱柱（150 mm×2.1 mm， 3.5 μm， 美国Waters公司）； Centrifuge5804台式高速离心机（美国Eppendorf公司）； D10 24型氮气浓缩仪（杭州奥盛仪器有限公司）； Milli Q纯水机（美国Millipore公司）； CNWBOND MAX固相萃取小柱（60 mg/3 mL，德国CNW科技公司）。
硝碘酚腈（Nitroxinil，NIT）精制对照品（纯度98.5%，批号 091205），氯羟柳胺（Oxyclozanide，OXY）精制对照品（纯度98.5%，批号1670811），氯氰碘柳胺钠（Closantel，CLO）精制对照品（纯度94.1%，批号 67111001），碘醚柳胺（Rafoxanide，RAF）精制对照品（纯度99.5%， 批号 0505028），均购自河北远征药业有限公司； 乙腈、甲醇、甲酸（色谱纯，德国CNW科技公司）； 乙酸铵（色谱纯，美国TEDIA公司）； 氨水、冰醋酸（分析纯，江苏强盛功能化学股份有限公司）； 实验用水为超纯水。
2.2 溶液的配制
标准储备液：准确称取适量的硝碘酚腈、氯羟柳胺、氯氰碘柳胺、碘醚柳胺对照品，用乙腈分别配制成1 g/L的单一标准储备液及100 μg/mL的混合标准溶液。1%三乙胺 乙腈溶液：取1.0 mL三乙胺，用乙腈定容至100 mL，混匀。25% 氨化乙腈溶液：取25.0 mL氨水，用乙腈定容至100 mL，混匀。5%甲酸 乙腈溶液；0.1%甲酸溶液。
2.3 色谱 质谱条件
2.3.1 色谱条件 C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）； 流速： 0.25 mL/min； 柱温： 35 ℃； 进样量： 5 μL； 流动相： 甲醇（A）， 乙腈（B）， 0.1%甲酸溶液（C）。梯度洗脱程序： 0.0 min， 15%A， 25%B； 0.0～1.0 min， 15%～30%A， 25%～70%B； 1.0～6.0 min， 30%A， 70%B； 6.0～6.5 min， 30%～15%A， 70%～25%B； 6.5～13.0 min， 15%A， 25%B。
2.3.2 质谱条件 用多反应监测（MRM）扫描模式； 电喷雾离子源（ESI）； 负离子扫描； 电喷雾电压
Symbolm@@ 3500 V， 离子源温度 650 ℃，气帘气压力15 kPa，雾化气压力60 kPa，辅助气压力 60 kPa。射入电压、碰撞能量、去簇电压、碰撞室射出电压及定性离子对、定量离子对等参数见表1。
2.4 样品的处理与净化
（1）肌肉、肝脏、肾脏组织样品 已匀浆组织样品在室温下自然解冻，准确称取（2.00±0.02）g，置于50 mL离心管中， 加入乙腈 丙酮混合液（60∶40，V/V）15 mL，漩涡混悬15 s，超声提取10 min，300 r/min振摇10 min，8000 r/min 离心10 min后收集上清液； 上清液中加入1 mL 5%氨水待净化。（2）脂肪组织样品 已匀浆组织样品在室温下自然解冻，准确称取（2.00±0.02）g，置于50 mL离心管中，加入1%三乙胺 乙腈溶液15 mL，漩涡混悬15 s，超声提取10 min，300 r/min振摇10 min，8000 r/min 离心10 min后收集上清液； 上清液中加入2 mL 5%氨水后， 置于
Symbolm@@ 20 ℃冷藏1 h，取出后在4 ℃下8000 r/min离心10 min。上清液转移至另一个50 mL离心管中，待净化。
MAX固相萃取柱预先用25%氨化 乙腈溶液3 mL活化，再将前述上清液装载入柱，以1.0 mL/min流速过柱。待上清液流出后，依次用3 mL水和3 mL甲醇分别淋洗，负压抽干后用5%甲酸 乙腈溶液3 mL洗脱，收集洗脱液，在40 ℃下氮气吹干，残渣用0.5 mL流动相溶解，转移至2 mL离心管，加入乙腈饱和的正己烷0.5 mL，涡旋，于4 ℃下15000 r/min离心10 min，上清液过0.22 μm滤膜，待测。
3 结果与讨论
3.1 质谱参数的确定
用针泵连续直接进样（单一标准溶液1 mg/L），发现ESI
准分子离子峰。优化各质谱参数，进行相应的子离子全扫描，以确定MRM特征诊断离子。根据欧盟 2002/657/EC[20]制定的分析方法确认的标准和程序规定，各药物的母离子、子离子及部分质谱参数见表1。
3. 2 色谱条件的优化
3.2.1 色谱柱的选择 由于硝碘酚腈、氯羟柳胺、氯氰碘柳胺、碘醚柳胺的脂溶性较高、极性小，所选色谱柱的固定相应为直链烷烃键合的硅胶，其中最常见的为十八烷基键合硅胶（即C18）。本研究考察了菲罗门Gemini C18（150 mm×2.0 mm， 5 μm）、CNW C18（250 mm×4.6 mm，5
和Waters C18 （150 mm×2.1 mm，3.5 μm）填料的色谱柱。氯氰碘柳胺和碘醚柳胺在Gemini C18色谱柱上峰形较宽，在样品检测时基质杂音较大； 在CNW C18色谱柱上，由于氯氰碘柳胺和碘醚柳胺极性较弱，当加大乙腈的比例后，这两者的分离效果不理想，而且纯标液的基线在后， 两种药物出峰之前容易漂移； Waters C18色谱柱对4种药物有良好的保留性质，各待测药物均可得到优异的峰型。因此采用Waters C18 色谱柱。
3.2.2 流动相的选择 比较了甲醇或乙腈（有机相）与乙酸铵缓冲溶液、甲酸水溶液、超纯水（水相）组合对峰型、灵敏度及分辨率的影响。研究表明， 选择甲醇或乙腈作为有机相， 均可对4种药物进行有效的分离，但是在甲醇为流动相时，硝碘酚腈的出峰时间在10.26 min，以乙腈为流动相时，硝碘酚腈的出峰时间在3.72 min。为了缩短药物的出峰时间和优化4种药物的峰形，选择乙腈和甲醇作为流动相。考察了甲醇或乙腈（有机相）与5 mmol/L乙酸铵、10 mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸溶液在不同梯度条件下对药物峰的影响，发现乙酸铵的加入，未能改善氯氰碘柳胺和碘醚柳胺的峰形， 峰形较宽，基质杂音较大。当选择乙腈和0.1%甲酸溶液时，需要加大有机相的比例才能对将氯氰碘柳胺和碘醚柳胺洗脱。当选择0.1%甲酸 乙腈 甲醇作为流动相时，采用2.3.1节所示方法进行梯度洗脱，4种药物均可得到良好的峰型。
3.3 样品前处理方法的研究
根据4种药物的理化性质以及文献＼[12，18，19]，考察了乙腈、1%三乙胺乙腈和1%醋酸丙酮、乙腈 丙酮、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇等的提取效果。发现甲醇、三氯甲烷、乙酸乙酯不能有效地提取这4种药物，回收率在40%～70%； 用乙腈或1%三乙胺乙腈时，提取回收率均能达到80%以上； 用1%醋酸丙酮提取后，加入5 mL氨水，出现较多杂质，且回收率不稳定（60%～75%）； 乙腈 丙酮混合液提取时，回收率均能达到80%以上，且乙腈 丙酮（60∶40，V/V）回收率偏高于乙腈 丙酮（80∶20，V/V）。乙腈具有较强的除蛋白和脱脂作用，对脂肪溶解性差，经过对比发现1%三乙胺乙腈作为脂肪组织的提取剂回收率较好，乙腈 丙酮（60∶40，V/V）对肌肉、肝脏、肾脏均有较好的提取效果。由于4种药物为弱酸性药物，且乙腈和丙酮的极性较强，过柱后， 硝碘酚腈的回收率在65%～70%，5%氨水溶液为碱性环境，通过加入5%氨水可以使4种药物给出质子，呈阴离子态，有利于其在阴离子交换柱上被保留。实验过程中，对比加入1、2和4 mL 5%氨水溶液，发现在肌肉、肝脏、肾脏提取液中加入1 mL 5%氨水溶液，在脂肪提取液中加入2 mL 5%氨水溶液，4种药物的回收率在80%～110%之间。
净化过程中，根据苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药的理化性质，直接比较了菲罗门 Strata X 柱、MAX柱的净化效果，发现硝碘酚腈和碘醚柳胺有很好的保留，回收率均在80%以上，而氯羟柳胺和氯氰碘柳胺在Strata X柱上的回收率较差，分别约为55%和32%。因此选用MAX小柱，对比了CNW MAX（60 mg/3 mL）、CNW MAX（500 mg/6 mL）及Waters MAX（60 mg/3 mL）3种小柱的净化效果。发现4种药物在CNW MAX柱的回收率均在80%。 考虑实验成本，最终选择CNW MAX（60 mg/3 mL）小柱。
图1和图2为4种苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药标准溶液和样品的MRM色谱图。4种药物依次是硝碘酚腈、氯羟柳胺、氯氰碘柳胺、碘醚柳胺，保留时间依次为6.29， 7.03， 8.22和8.47 min。
3.4 基质效应
样品基质溶液对目标物的电喷雾离子化有很大影响，可增强或抑制信号响应，进而影响测定结果的准确度与精密度。本实验在空白组织基质提取液中添加不同浓度的苯酚类和水杨酸苯胺类药物混合标准溶液，与相应流动相（纯溶剂）中的信号强度（峰面积）相比较，发现 4 种苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药在组织中的响应值均低于纯溶剂。为了降低基质效应，采用MAX固相萃取柱对样品进行净化，使离子抑制效应明显降低。其次，优化色谱分离条件，分离内源性物质。由于基质效应主要出现在出峰较早的时间段，所以使用梯度洗脱方法调节分析物与内源性物质的出峰时间，使二者分离。此外，本研究采用基质匹配标准法定量分析，消除基质效应。
3.5 线性范围与检出限
为减少或消除基质效应的影响，采用空白基质匹配标准溶液法获得组织样品的标准曲线。准确称取2 g组织于50 mL 离心管中，按照2.4节方法处理，在空白样品经提取净化吹干后的残余物中添加标准工作液，得1， 2， 5， 10， 50和100 μg/L的基质加标溶液，用 HPLC MS/MS 分析，每个浓度平行测定5次。超出100 μg/L的基质匹配标准溶液用空白样品基质提取液稀释至1～100 μg/L范围内，进行LC MS/MS测定，用于单点法校准。按所得峰面积平均值对相应浓度作标准曲线，以峰面积（y）对其质量浓度（x，μg/L）作图，求得回归方程和相关系数。采用空白组织添加低浓度标准溶液，按2.4节方法进行处理后检测，以信噪比S/N≥3确定检出限（LOD），以S/N≥10 确定定量限（LOQ）。
结果表明，4种苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药在1～100 μg/L 范围内线性关系良好，相关系数在0.9901～0.9999之间，检出限均为1 μg/kg，定量限均为2.5 μg/kg，满足残留检测的要求。
3.6 准确度与精密度
采用相应基质标准溶液单点校正法计算回收率，按照LOQ， 0.5 MRL， MRL， 2MRL作为添加浓度，每个添加水平平行5份同日测定，连续测定5日，结果表明，4 种苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药的平均回收率为71%～112% ，日内RSD为1.1%～14.0%，日间RSD为6.4%～14.7%（表2），说明方法的重复性好，通用性强，可满足牛羊组织中4种苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药残留检测的要求。
3.7 抽样检测
从市场购买牛、羊的脂肪、肌肉各100 g，整个肾脏，整个肝脏。每种动物每种组织样品各取5份，共抽检40份样品，每份样品平行2个样，按本方法进行制样和检测。结果表明，1份羊肾脏检测出13 μg/kg硝碘酚腈残留，1份牛肝脏检测出45 μg/kg氯氰碘柳胺残留，其余样品未检测出苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药残留。综上可知，本方法可检测牛、羊肌肉、脂肪、肝脏和肾脏组织中苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药的残留量，适用于检测动物可食性组织中苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药的残留。
References
1 WU Yong Kui， DAI Xiang Guo， TIAN Hui Ying.Chinese Journal of Veterinary Science， 2001， 21（2）： 167-169
吴永魁， 戴向国， 田慧英. 中国兽医学报， 2001， 21（2）： 167-169
2 MA Hong Xia， JIA Dong Shu， GONG Qian， LIU Xiao Hua， YU Shou Ping， YANG Xiao Bing.Journal of Jilin Agricultural University， 2001， 23（3）： 107-110
马红霞， 贾冬舒， 龚 倩， 刘晓华， 于守平， 杨小冰. 吉林农业大学学报， 2001， 23（3）： 107-110
3 ZHAO Hai Shuang， ZHOU Le.Progress in Veterinary Medicine， 2001， 22（4）： 95-96
赵海双， 周 乐. 动物医学进展， 2001， 22（4）： 95-96
4 MOA.Bulletin 235 2002，Maximum Residue Limits of Veterinary Drugs in Animal Derived Food.National Standards of People′s Republic of China
动物源性食品中兽药最高残留限量. 中华人民共和国国家标准.农业部235号公告 2002
5 LI Zhe， LIN Wei Xuan， SUN Xing Quan.Food Research and Development， 2008， 29（5）： 110-113
李 哲， 林维宣， 孙兴权. 食品研究与开发， 2008， 29（5）： 110-113
6 Jo K， Cho H J， Yi H， Cho S M， Park J A， Kwon C H， Park H R， Kwon K S， Shin H C.Lab. Anim. Res.，2011， 27（1）： 37-40
7 LIU Yong Jun， WU Yin Liang， JIANG Yan Bin.Animal Husbandry and Veterinary Medicine， 2011， 43（4）： 56-58
刘勇军， 吴银良， 姜艳彬.畜牧与兽医， 2011， 43（4）： 56-58
8 LIU Ying Gui， FANG Jun Tian， LI Rui He， HAN Qi， ZHANG Ping.Chinese Journal of Veterinary Drug， 2008， 42（3）： 23-25
刘迎贵， 方俊天， 李瑞和， 韩 琪， 张 平. 中国兽药杂志， 2008， 42（3）： 23-25
9 Sun H W， Wang F C， Ai L F.J. Chromatogr. Sci.， 2008， 46（4）： 351-355
10 Yeung H S， Lee W O， Wong Y T.J.Sep. Sci.， 2010， 33（2）： 206-211
11 Sakamoto M， Takeba K， Sasamoto T， Kusano T， Hayashi H， Kanai S， Kanda M， Nagayama T.J. AOAC. Int.， 2010， 93（4）： 1340-1346
12 Caldow M， Sharman M， Kelly M， Day J， Hird S， Tarbin J A.J. Chromatogr.A， 2009， 1216（46）： 8200-8205
13 Kinsella B， Lehotay S J， Mastovska K， Lightfield A R， Furey A， Danaher M.Anal. Chim. Acta， 2009， 637 （1/2）： 196-207
14 Lai S S L， Yeung H S， Lee W O， Ho C， Wong Y T.J. Sep. Sci.， 2011， 34（12）： 1366-1374
15 Whelan M， Bloemhoff Y， Furey A， Sayers R， Danaher M.J. Agric. Food. Chem.， 2011， 59（14）： 7793-7797
16 Whelan M， Kinsella B， Furey A， Moloney M， Cantwell H， Lehotay S J， Danaher M.J. Chromatogr. A，2010， 1217（27）： 4612-4622
17 Commission Decision（2002/657/EC）.Official Journal of the European Communities， 2002 /L221/8 36
刘勇军， 吴银良， 姜艳彬.畜牧与兽医， 2011， 43（4）： 56-58
8 LIU Ying Gui， FANG Jun Tian， LI Rui He， HAN Qi， ZHANG Ping.Chinese Journal of Veterinary Drug， 2008， 42（3）： 23-25
刘迎贵， 方俊天， 李瑞和， 韩 琪， 张 平. 中国兽药杂志， 2008， 42（3）： 23-25
9 Sun H W， Wang F C， Ai L F.J. Chromatogr. Sci.， 2008， 46（4）： 351-355
10 Yeung H S， Lee W O， Wong Y T.J.Sep. Sci.， 2010， 33（2）： 206-211
11 Sakamoto M， Takeba K， Sasamoto T， Kusano T， Hayashi H， Kanai S， Kanda M， Nagayama T.J. AOAC. Int.， 2010， 93（4）： 1340-1346
12 Caldow M， Sharman M， Kelly M， Day J， Hird S， Tarbin J A.J. Chromatogr.A， 2009， 1216（46）： 8200-8205
13 Kinsella B， Lehotay S J， Mastovska K， Lightfield A R， Furey A， Danaher M.Anal. Chim. Acta， 2009， 637 （1/2）： 196-207
14 Lai S S L， Yeung H S， Lee W O， Ho C， Wong Y T.J. Sep. Sci.， 2011， 34（12）： 1366-1374
15 Whelan M， Bloemhoff Y， Furey A， Sayers R， Danaher M.J. Agric. Food. Chem.， 2011， 59（14）： 7793-7797
16 Whelan M， Kinsella B， Furey A， Moloney M， Cantwell H， Lehotay S J， Danaher M.J. Chromatogr. A，2010， 1217（27）： 4612-4622
17 Commission Decision（2002/657/EC）.Official Journal of the European Communities， 2002 /L221/8 36
刘勇军， 吴银良， 姜艳彬.畜牧与兽医， 2011， 43（4）： 56-58
8 LIU Ying Gui， FANG Jun Tian， LI Rui He， HAN Qi， ZHANG Ping.Chinese Journal of Veterinary Drug， 2008， 42（3）： 23-25
刘迎贵， 方俊天， 李瑞和， 韩 琪， 张 平. 中国兽药杂志， 2008， 42（3）： 23-25
9 Sun H W， Wang F C， Ai L F.J. Chromatogr. Sci.， 2008， 46（4）： 351-355
10 Yeung H S， Lee W O， Wong Y T.J.Sep. Sci.， 2010， 33（2）： 206-211
11 Sakamoto M， Takeba K， Sasamoto T， Kusano T， Hayashi H， Kanai S， Kanda M， Nagayama T.J. AOAC. Int.， 2010， 93（4）： 1340-1346
12 Caldow M， Sharman M， Kelly M， Day J， Hird S， Tarbin J A.J. Chromatogr.A， 2009， 1216（46）： 8200-8205
13 Kinsella B， Lehotay S J， Mastovska K， Lightfield A R， Furey A， Danaher M.Anal. Chim. Acta， 2009， 637 （1/2）： 196-207
14 Lai S S L， Yeung H S， Lee W O， Ho C， Wong Y T.J. Sep. Sci.， 2011， 34（12）： 1366-1374
15 Whelan M， Bloemhoff Y， Furey A， Sayers R， Danaher M.J. Agric. Food. Chem.， 2011， 59（14）： 7793-7797
16 Whelan M， Kinsella B， Furey A， Moloney M， Cantwell H， Lehotay S J， Danaher M.J. Chromatogr. A，2010， 1217（27）： 4612-4622
17 Commission Decision（2002/657/EC）.Official Journal of the European Communities， 2002 /L221/8 36
摘 要 建立了高效液相色谱 串联质谱法同时测定牛、羊组织中硝碘酚腈、氯羟柳胺、氯氰碘柳胺、碘醚柳胺4种苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药的多残留检测方法。样品用乙腈 丙酮（60∶40，V/V）（肌肉、肝脏和肾脏组织）或1%三乙胺乙腈（脂肪组织）超声提取，MAX阴离子固相萃取柱净化，液相色谱分离，采用多反应监测负离子模式对4种药物同时进行定性定量分析，在1～100 μg/L 范围内，4种药物与其对应峰面积的线性关系良好，相关系数均大于0.99。在牛、羊组织中的检出限（LOD）均为1 μg/kg，定量限（LOQ）均为2.5 μg/kg。 在LOQ、0.5倍最高残留限量（MRL）、MRL、2倍MRL添加水平下，4 种药物的平均回收率在71%～112%之间，日内相对标准偏差（RSD）在1.1%～14.0%之间，日间RSD在6.4%～14.7%之间。采用本方法对市场上动物可食性组织进行抽样检测，共抽检40份样品，2份样品检测出苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药残留。
关键词 苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药； 牛羊组织； 多残留； 高效液相色谱 串联质谱
1 引 言
氯羟柳胺（OXY）、硝碘酚腈（NIT）、氯氰碘柳胺（CLO）、碘醚柳胺（RAF）是一类苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药，作用机理是通过阻断肝片吸虫的氧化磷酸化过程，使虫体麻痹、死亡，用于驱杀牛、羊的肝片吸虫、蛔虫和绦虫，对血毛线虫、巨片吸虫和羊蝇蛆亦有较好作用。随着国内驱虫药的广泛应用和研究，发现碘醚柳胺有明显胚胎毒性[1]； 氯氰碘柳胺对肝、肾具有一定的毒、副作用[2]； 高剂量硝碘酚腈可引起心脏、神经、肌肉和呼吸的损害[3]。欧洲医药评价署、澳大利亚以及食品法典委员会均已制定了上述药物的最大残留限量（Maximum residue limit，MRL），残留标志物均为原形药物，残留监测的动物是牛羊。靶组织MRL分别如下：硝碘酚腈：牛、羊，肌肉400 μg/kg、脂肪200 μg/kg、肝20 μg/kg、肾400 μg/kg。碘醚柳胺：牛，肌肉30 μg/kg、脂肪30 μg/kg、肝10 μg/kg、肾40 μg/kg； 羊，肌肉100 μg/kg、脂肪250 μg/kg、肝150 μg/kg、肾150 μg/kg。氯氰碘柳胺：牛，肌肉1000 μg/kg、脂肪3000 μg/kg、肝1000 μg/kg、肾3000 μg/kg； 羊，肌肉1500 μg/kg、脂肪2000 μg/kg、肝1500 μg/kg、肾5000 μg/kg。氯羟柳胺：牛、绵羊，肌肉20 μg/kg、脂肪20 μg/kg、肝500 μg/kg、肾100 μg/kg。我国农业部（2003）235号公告[4]已经颁布硝碘酚腈、碘醚柳胺、氯氰碘柳胺的最高残留限量，氯羟柳胺的最高残留限量正在制定中。
目前，关于苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药在组织中残留的检测方法主要有高效液相色谱与紫外检测器[5～8]、荧光检测器和质谱检测器联用[9，10]、高效液相色谱 串联质谱法[11～16]。国内仅报道高效液相色谱 串联质谱法[9]检测氯氰碘柳胺在牛组织和牛奶中残留的研究，国外对于苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药在组织中残留分析方法的报道主要局限于某种组织或者是单残留和两种药物的残留检测方法，尚未报道关于4种苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药在牛、羊组织中的多残留检测方法。本研究采用HPLC MS/MS分析牛、羊组织中4种苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药的多残留，方法前处理简便易行，灵敏度高，精密度及重复性好，适用于牛、羊组织中苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药的多残留检测。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
Agilent 1200型液相色谱仪（美国安捷伦公司）； API4000电喷雾 串联四极杆质谱仪，配Analyst 4.1.5 软件（美国应用生物系统公司）； C18 色谱柱（150 mm×2.1 mm， 3.5 μm， 美国Waters公司）； Centrifuge5804台式高速离心机（美国Eppendorf公司）； D10 24型氮气浓缩仪（杭州奥盛仪器有限公司）； Milli Q纯水机（美国Millipore公司）； CNWBOND MAX固相萃取小柱（60 mg/3 mL，德国CNW科技公司）。
硝碘酚腈（Nitroxinil，NIT）精制对照品（纯度98.5%，批号 091205），氯羟柳胺（Oxyclozanide，OXY）精制对照品（纯度98.5%，批号1670811），氯氰碘柳胺钠（Closantel，CLO）精制对照品（纯度94.1%，批号 67111001），碘醚柳胺（Rafoxanide，RAF）精制对照品（纯度99.5%， 批号 0505028），均购自河北远征药业有限公司； 乙腈、甲醇、甲酸（色谱纯，德国CNW科技公司）； 乙酸铵（色谱纯，美国TEDIA公司）； 氨水、冰醋酸（分析纯，江苏强盛功能化学股份有限公司）； 实验用水为超纯水。
2.2 溶液的配制
标准储备液：准确称取适量的硝碘酚腈、氯羟柳胺、氯氰碘柳胺、碘醚柳胺对照品，用乙腈分别配制成1 g/L的单一标准储备液及100 μg/mL的混合标准溶液。1%三乙胺 乙腈溶液：取1.0 mL三乙胺，用乙腈定容至100 mL，混匀。25% 氨化乙腈溶液：取25.0 mL氨水，用乙腈定容至100 mL，混匀。5%甲酸 乙腈溶液；0.1%甲酸溶液。
2.3 色谱 质谱条件
2.3.1 色谱条件 C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）； 流速： 0.25 mL/min； 柱温： 35 ℃； 进样量： 5 μL； 流动相： 甲醇（A）， 乙腈（B）， 0.1%甲酸溶液（C）。梯度洗脱程序： 0.0 min， 15%A， 25%B； 0.0～1.0 min， 15%～30%A， 25%～70%B； 1.0～6.0 min， 30%A， 70%B； 6.0～6.5 min， 30%～15%A， 70%～25%B； 6.5～13.0 min， 15%A， 25%B。
2.3.2 质谱条件 用多反应监测（MRM）扫描模式； 电喷雾离子源（ESI）； 负离子扫描； 电喷雾电压
Symbolm@@ 3500 V， 离子源温度 650 ℃，气帘气压力15 kPa，雾化气压力60 kPa，辅助气压力 60 kPa。射入电压、碰撞能量、去簇电压、碰撞室射出电压及定性离子对、定量离子对等参数见表1。
2.4 样品的处理与净化
（1）肌肉、肝脏、肾脏组织样品 已匀浆组织样品在室温下自然解冻，准确称取（2.00±0.02）g，置于50 mL离心管中， 加入乙腈 丙酮混合液（60∶40，V/V）15 mL，漩涡混悬15 s，超声提取10 min，300 r/min振摇10 min，8000 r/min 离心10 min后收集上清液； 上清液中加入1 mL 5%氨水待净化。（2）脂肪组织样品 已匀浆组织样品在室温下自然解冻，准确称取（2.00±0.02）g，置于50 mL离心管中，加入1%三乙胺 乙腈溶液15 mL，漩涡混悬15 s，超声提取10 min，300 r/min振摇10 min，8000 r/min 离心10 min后收集上清液； 上清液中加入2 mL 5%氨水后， 置于
Symbolm@@ 20 ℃冷藏1 h，取出后在4 ℃下8000 r/min离心10 min。上清液转移至另一个50 mL离心管中，待净化。
MAX固相萃取柱预先用25%氨化 乙腈溶液3 mL活化，再将前述上清液装载入柱，以1.0 mL/min流速过柱。待上清液流出后，依次用3 mL水和3 mL甲醇分别淋洗，负压抽干后用5%甲酸 乙腈溶液3 mL洗脱，收集洗脱液，在40 ℃下氮气吹干，残渣用0.5 mL流动相溶解，转移至2 mL离心管，加入乙腈饱和的正己烷0.5 mL，涡旋，于4 ℃下15000 r/min离心10 min，上清液过0.22 μm滤膜，待测。
3 结果与讨论
3.1 质谱参数的确定
用针泵连续直接进样（单一标准溶液1 mg/L），发现ESI
准分子离子峰。优化各质谱参数，进行相应的子离子全扫描，以确定MRM特征诊断离子。根据欧盟 2002/657/EC[20]制定的分析方法确认的标准和程序规定，各药物的母离子、子离子及部分质谱参数见表1。
3. 2 色谱条件的优化
3.2.1 色谱柱的选择 由于硝碘酚腈、氯羟柳胺、氯氰碘柳胺、碘醚柳胺的脂溶性较高、极性小，所选色谱柱的固定相应为直链烷烃键合的硅胶，其中最常见的为十八烷基键合硅胶（即C18）。本研究考察了菲罗门Gemini C18（150 mm×2.0 mm， 5 μm）、CNW C18（250 mm×4.6 mm，5
和Waters C18 （150 mm×2.1 mm，3.5 μm）填料的色谱柱。氯氰碘柳胺和碘醚柳胺在Gemini C18色谱柱上峰形较宽，在样品检测时基质杂音较大； 在CNW C18色谱柱上，由于氯氰碘柳胺和碘醚柳胺极性较弱，当加大乙腈的比例后，这两者的分离效果不理想，而且纯标液的基线在后， 两种药物出峰之前容易漂移； Waters C18色谱柱对4种药物有良好的保留性质，各待测药物均可得到优异的峰型。因此采用Waters C18 色谱柱。
3.2.2 流动相的选择 比较了甲醇或乙腈（有机相）与乙酸铵缓冲溶液、甲酸水溶液、超纯水（水相）组合对峰型、灵敏度及分辨率的影响。研究表明， 选择甲醇或乙腈作为有机相， 均可对4种药物进行有效的分离，但是在甲醇为流动相时，硝碘酚腈的出峰时间在10.26 min，以乙腈为流动相时，硝碘酚腈的出峰时间在3.72 min。为了缩短药物的出峰时间和优化4种药物的峰形，选择乙腈和甲醇作为流动相。考察了甲醇或乙腈（有机相）与5 mmol/L乙酸铵、10 mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸溶液在不同梯度条件下对药物峰的影响，发现乙酸铵的加入，未能改善氯氰碘柳胺和碘醚柳胺的峰形， 峰形较宽，基质杂音较大。当选择乙腈和0.1%甲酸溶液时，需要加大有机相的比例才能对将氯氰碘柳胺和碘醚柳胺洗脱。当选择0.1%甲酸 乙腈 甲醇作为流动相时，采用2.3.1节所示方法进行梯度洗脱，4种药物均可得到良好的峰型。
3.3 样品前处理方法的研究
根据4种药物的理化性质以及文献＼[12，18，19]，考察了乙腈、1%三乙胺乙腈和1%醋酸丙酮、乙腈 丙酮、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇等的提取效果。发现甲醇、三氯甲烷、乙酸乙酯不能有效地提取这4种药物，回收率在40%～70%； 用乙腈或1%三乙胺乙腈时，提取回收率均能达到80%以上； 用1%醋酸丙酮提取后，加入5 mL氨水，出现较多杂质，且回收率不稳定（60%～75%）； 乙腈 丙酮混合液提取时，回收率均能达到80%以上，且乙腈 丙酮（60∶40，V/V）回收率偏高于乙腈 丙酮（80∶20，V/V）。乙腈具有较强的除蛋白和脱脂作用，对脂肪溶解性差，经过对比发现1%三乙胺乙腈作为脂肪组织的提取剂回收率较好，乙腈 丙酮（60∶40，V/V）对肌肉、肝脏、肾脏均有较好的提取效果。由于4种药物为弱酸性药物，且乙腈和丙酮的极性较强，过柱后， 硝碘酚腈的回收率在65%～70%，5%氨水溶液为碱性环境，通过加入5%氨水可以使4种药物给出质子，呈阴离子态，有利于其在阴离子交换柱上被保留。实验过程中，对比加入1、2和4 mL 5%氨水溶液，发现在肌肉、肝脏、肾脏提取液中加入1 mL 5%氨水溶液，在脂肪提取液中加入2 mL 5%氨水溶液，4种药物的回收率在80%～110%之间。
净化过程中，根据苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药的理化性质，直接比较了菲罗门 Strata X 柱、MAX柱的净化效果，发现硝碘酚腈和碘醚柳胺有很好的保留，回收率均在80%以上，而氯羟柳胺和氯氰碘柳胺在Strata X柱上的回收率较差，分别约为55%和32%。因此选用MAX小柱，对比了CNW MAX（60 mg/3 mL）、CNW MAX（500 mg/6 mL）及Waters MAX（60 mg/3 mL）3种小柱的净化效果。发现4种药物在CNW MAX柱的回收率均在80%。 考虑实验成本，最终选择CNW MAX（60 mg/3 mL）小柱。
图1和图2为4种苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药标准溶液和样品的MRM色谱图。4种药物依次是硝碘酚腈、氯羟柳胺、氯氰碘柳胺、碘醚柳胺，保留时间依次为6.29， 7.03， 8.22和8.47 min。
3.4 基质效应
样品基质溶液对目标物的电喷雾离子化有很大影响，可增强或抑制信号响应，进而影响测定结果的准确度与精密度。本实验在空白组织基质提取液中添加不同浓度的苯酚类和水杨酸苯胺类药物混合标准溶液，与相应流动相（纯溶剂）中的信号强度（峰面积）相比较，发现 4 种苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药在组织中的响应值均低于纯溶剂。为了降低基质效应，采用MAX固相萃取柱对样品进行净化，使离子抑制效应明显降低。其次，优化色谱分离条件，分离内源性物质。由于基质效应主要出现在出峰较早的时间段，所以使用梯度洗脱方法调节分析物与内源性物质的出峰时间，使二者分离。此外，本研究采用基质匹配标准法定量分析，消除基质效应。
3.5 线性范围与检出限
为减少或消除基质效应的影响，采用空白基质匹配标准溶液法获得组织样品的标准曲线。准确称取2 g组织于50 mL 离心管中，按照2.4节方法处理，在空白样品经提取净化吹干后的残余物中添加标准工作液，得1， 2， 5， 10， 50和100 μg/L的基质加标溶液，用 HPLC MS/MS 分析，每个浓度平行测定5次。超出100 μg/L的基质匹配标准溶液用空白样品基质提取液稀释至1～100 μg/L范围内，进行LC MS/MS测定，用于单点法校准。按所得峰面积平均值对相应浓度作标准曲线，以峰面积（y）对其质量浓度（x，μg/L）作图，求得回归方程和相关系数。采用空白组织添加低浓度标准溶液，按2.4节方法进行处理后检测，以信噪比S/N≥3确定检出限（LOD），以S/N≥10 确定定量限（LOQ）。
结果表明，4种苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药在1～100 μg/L 范围内线性关系良好，相关系数在0.9901～0.9999之间，检出限均为1 μg/kg，定量限均为2.5 μg/kg，满足残留检测的要求。
3.6 准确度与精密度
采用相应基质标准溶液单点校正法计算回收率，按照LOQ， 0.5 MRL， MRL， 2MRL作为添加浓度，每个添加水平平行5份同日测定，连续测定5日，结果表明，4 种苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药的平均回收率为71%～112% ，日内RSD为1.1%～14.0%，日间RSD为6.4%～14.7%（表2），说明方法的重复性好，通用性强，可满足牛羊组织中4种苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药残留检测的要求。
3.7 抽样检测
从市场购买牛、羊的脂肪、肌肉各100 g，整个肾脏，整个肝脏。每种动物每种组织样品各取5份，共抽检40份样品，每份样品平行2个样，按本方法进行制样和检测。结果表明，1份羊肾脏检测出13 μg/kg硝碘酚腈残留，1份牛肝脏检测出45 μg/kg氯氰碘柳胺残留，其余样品未检测出苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药残留。综上可知，本方法可检测牛、羊肌肉、脂肪、肝脏和肾脏组织中苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药的残留量，适用于检测动物可食性组织中苯酚类和水杨酸苯胺类抗蠕虫药的残留。
References
1 WU Yong Kui， DAI Xiang Guo， TIAN Hui Ying.Chinese Journal of Veterinary Science， 2001， 21（2）： 167-169
吴永魁， 戴向国， 田慧英. 中国兽医学报， 2001， 21（2）： 167-169
2 MA Hong Xia， JIA Dong Shu， GONG Qian， LIU Xiao Hua， YU Shou Ping， YANG Xiao Bing.Journal of Jilin Agricultural University， 2001， 23（3）： 107-110
马红霞， 贾冬舒， 龚 倩， 刘晓华， 于守平， 杨小冰. 吉林农业大学学报， 2001， 23（3）： 107-110
3 ZHAO Hai Shuang， ZHOU Le.Progress in Veterinary Medicine， 2001， 22（4）： 95-96
赵海双， 周 乐. 动物医学进展， 2001， 22（4）： 95-96
4 MOA.Bulletin 235 2002，Maximum Residue Limits of Veterinary Drugs in Animal Derived Food.National Standards of People′s Republic of China
动物源性食品中兽药最高残留限量. 中华人民共和国国家标准.农业部235号公告 2002
5 LI Zhe， LIN Wei Xuan， SUN Xing Quan.Food Research and Development， 2008， 29（5）： 110-113
李 哲， 林维宣， 孙兴权. 食品研究与开发， 2008， 29（5）： 110-113
6 Jo K， Cho H J， Yi H， Cho S M， Park J A， Kwon C H， Park H R， Kwon K S， Shin H C.Lab. Anim. Res.，2011， 27（1）： 37-40
7 LIU Yong Jun， WU Yin Liang， JIANG Yan Bin.Animal Husbandry and Veterinary Medicine， 2011， 43（4）： 56-58
刘勇军， 吴银良， 姜艳彬.畜牧与兽医， 2011， 43（4）： 56-58
8 LIU Ying Gui， FANG Jun Tian， LI Rui He， HAN Qi， ZHANG Ping.Chinese Journal of Veterinary Drug， 2008， 42（3）： 23-25
刘迎贵， 方俊天， 李瑞和， 韩 琪， 张 平. 中国兽药杂志， 2008， 42（3）： 23-25
9 Sun H W， Wang F C， Ai L F.J. Chromatogr. Sci.， 2008， 46（4）： 351-355
10 Yeung H S， Lee W O， Wong Y T.J.Sep. Sci.， 2010， 33（2）： 206-211
11 Sakamoto M， Takeba K， Sasamoto T， Kusano T， Hayashi H， Kanai S， Kanda M， Nagayama T.J. AOAC. Int.， 2010， 93（4）： 1340-1346
12 Caldow M， Sharman M， Kelly M， Day J， Hird S， Tarbin J A.J. Chromatogr.A， 2009， 1216（46）： 8200-8205
13 Kinsella B， Lehotay S J， Mastovska K， Lightfield A R， Furey A， Danaher M.Anal. Chim. Acta， 2009， 637 （1/2）： 196-207
14 Lai S S L， Yeung H S， Lee W O， Ho C， Wong Y T.J. Sep. Sci.， 2011， 34（12）： 1366-1374
15 Whelan M， Bloemhoff Y， Furey A， Sayers R， Danaher M.J. Agric. Food. Chem.， 2011， 59（14）： 7793-7797
16 Whelan M， Kinsella B， Furey A， Moloney M， Cantwell H， Lehotay S J， Danaher M.J. Chromatogr. A，2010， 1217（27）： 4612-4622
17 Commission Decision（2002/657/EC）.Official Journal of the European Communities， 2002 /L221/8 36
刘勇军， 吴银良， 姜艳彬.畜牧与兽医， 2011， 43（4）： 56-58
8 LIU Ying Gui， FANG Jun Tian， LI Rui He， HAN Qi， ZHANG Ping.Chinese Journal of Veterinary Drug， 2008， 42（3）： 23-25
刘迎贵， 方俊天， 李瑞和， 韩 琪， 张 平. 中国兽药杂志， 2008， 42（3）： 23-25
9 Sun H W， Wang F C， Ai L F.J. Chromatogr. Sci.， 2008， 46（4）： 351-355
10 Yeung H S， Lee W O， Wong Y T.J.Sep. Sci.， 2010， 33（2）： 206-211
11 Sakamoto M， Takeba K， Sasamoto T， Kusano T， Hayashi H， Kanai S， Kanda M， Nagayama T.J. AOAC. Int.， 2010， 93（4）： 1340-1346
12 Caldow M， Sharman M， Kelly M， Day J， Hird S， Tarbin J A.J. Chromatogr.A， 2009， 1216（46）： 8200-8205
13 Kinsella B， Lehotay S J， Mastovska K， Lightfield A R， Furey A， Danaher M.Anal. Chim. Acta， 2009， 637 （1/2）： 196-207
14 Lai S S L， Yeung H S， Lee W O， Ho C， Wong Y T.J. Sep. Sci.， 2011， 34（12）： 1366-1374
15 Whelan M， Bloemhoff Y， Furey A， Sayers R， Danaher M.J. Agric. Food. Chem.， 2011， 59（14）： 7793-7797
16 Whelan M， Kinsella B， Furey A， Moloney M， Cantwell H， Lehotay S J， Danaher M.J. Chromatogr. A，2010， 1217（27）： 4612-4622
17 Commission Decision（2002/657/EC）.Official Journal of the European Communities， 2002 /L221/8 36
刘勇军， 吴银良， 姜艳彬.畜牧与兽医， 2011， 43（4）： 56-58
8 LIU Ying Gui， FANG Jun Tian， LI Rui He， HAN Qi， ZHANG Ping.Chinese Journal of Veterinary Drug， 2008， 42（3）： 23-25
刘迎贵， 方俊天， 李瑞和， 韩 琪， 张 平. 中国兽药杂志， 2008， 42（3）： 23-25
9 Sun H W， Wang F C， Ai L F.J. Chromatogr. Sci.， 2008， 46（4）： 351-355
10 Yeung H S， Lee W O， Wong Y T.J.Sep. Sci.， 2010， 33（2）： 206-211
11 Sakamoto M， Takeba K， Sasamoto T， Kusano T， Hayashi H， Kanai S， Kanda M， Nagayama T.J. AOAC. Int.， 2010， 93（4）： 1340-1346
12 Caldow M， Sharman M， Kelly M， Day J， Hird S， Tarbin J A.J. Chromatogr.A， 2009， 1216（46）： 8200-8205
13 Kinsella B， Lehotay S J， Mastovska K， Lightfield A R， Furey A， Danaher M.Anal. Chim. Acta， 2009， 637 （1/2）： 196-207
14 Lai S S L， Yeung H S， Lee W O， Ho C， Wong Y T.J. Sep. Sci.， 2011， 34（12）： 1366-1374
15 Whelan M， Bloemhoff Y， Furey A， Sayers R， Danaher M.J. Agric. Food. Chem.， 2011， 59（14）： 7793-7797
16 Whelan M， Kinsella B， Furey A， Moloney M， Cantwell H， Lehotay S J， Danaher M.J. Chromatogr. A，2010， 1217（27）： 4612-4622
17 Commission Decision（2002/657/EC）.Official Journal of the European Communities， 2002 /L221/8 36
