新型靛红衍生化β环糊精键合SBA 15液相色谱固定相的制备与表征
张杨+李来生+程彪平+周仁丹+聂桂珍??
摘 要 利用靛红的羰基与β环糊精单取代乙二胺的缩合反应，合成得到一种靛红衍生化β环糊精Schiff碱类化合物。以3 异氰酸丙基三乙氧基硅烷为偶联剂，将其键合到自制的有序介孔二氧化硅材料SBA 15表面，制得一种新型的靛红衍生化β环糊精键合SBA 15液相色谱固定相（ISCDP）。分别对β环糊精衍生物、SBA 15及固定相进行必要的结构表征。在反相色谱条件下，以卤代尿嘧啶类极性化合物和二取代苯位置异构体为探针，评价新固定相的基本色谱性能。在极性有机溶剂和反相模式下，将新固定相分别用于β受体阻滞剂药物和丹磺酰化氨基酸对映体的拆分，探讨了相关色谱分离机理。实验表明，靛红吲哚环的引入，增强了环糊精类固定相对卤代尿嘧啶的反相色谱分离能力，分析时间小于7 min。固定相分离硝基苯胺、氨基苯酚和苯二酚的位置异构体时也表现出较高的立体选择性，其中对位异构体均最后被洗脱，这与包结作用相关；靛红衍生化β环糊精配体也提高了固定相的手性分离能力，除疏水作用外，靛红衍生化β环糊精配体还能提供偶极、氢键、π π和包结等作用，多种协同作用力有利于提高新固定相的手性和非手性分离的选择性。SBA 15作为键合基质，其有序的孔结构有利于保持色谱柱的良好渗透性和小的传质阻力，在快速高效分离分析中具有应用潜能。
关键词 高效液相色谱法；靛红衍生化β环糊精键合相；SBA 15；手性和非手性分离机理
1 引 言
β受体阻滞剂是一类用于治疗高血压和心绞痛的手性药物，其对映体的药理、药代动力学和毒理等差异较大。通常，S 构型药物比R构型临床疗效高（约100倍），部分对映体存在拮抗和毒性[1]。因此，建立准确、高效、快速的手性分离方法，对食品安全、有效的药物质量监控和对映体药代动力学研究都具有重要意义[2]。
高效液相色谱（HPLC）由于选择性好、分离效率高、色谱条件温和、样品兼容性好，仪器日趋成熟等特点，已发展成为手性药物对映体拆分和含量测定的首选方法之一[3，4]。由于对映体的性质极其相似，发展选择性高和柱性能优越的固定相是手性药物分离与研究中的重要课题之一。β受体阻滞剂的对映体拆分涉及到常见的手性固定相（CSPs），如刷型、大环抗生素类、合成或半合成聚合物类、蛋白质类和分子印迹类等[5～11]，以纤维素类和大环抗生素类商品手性柱的报道居多，手性分离时间一般需要20～50 min。 2012年，Morante Zarcero等[9]比较了4根纤维素和大环抗生素商品柱 （Chiralpak AD H， Lux Cellulose 1， Chirobiotic T， Sumichiral OA 4900） 在极性有机和正相色谱模式下对普萘洛尔、美托洛尔、阿替洛尔和吲哚洛尔的手性拆分能力，研究表明， Chirobiotic T是唯一能完全拆分4种洛尔对映体的色谱柱。丁国生等[10]制备了去甲万古霉素固定相，在极性模式下成功拆分了普萘洛尔、美托洛尔、阿替洛尔和烯丙洛尔。李芳等[11]采用直链淀粉商品柱ChiralPak AD H拆分了比索洛尔对映体，考察了流动相的组成、流速及柱温对分离的影响。 叶金星等[12]采用新型的全苯基化环糊精商品手性柱（Shiseido CD Ph），以乙腈 0.5 mol/L NaClO4（60∶40，V/V， pH 4.0）为流动相，拆分了3种常见的洛尔类手性药物对映体。
环糊精（Cyclodextrins，CD）是由D吡喃葡萄糖单元通过α 1，4 糖苷键连接而成的环状分子，含多个手性碳原子，具有疏水性的空腔和腔外亲水性的羟基结构，在手性分离方面极具应用潜力。Armstrong等[13，14]用环氧基偶联剂与βCD开环反应，首次制备了醚键连接的稳定的βCD键合手性固定相，之后分别经异氰酸酯基和酰基改性，这类固定相能为溶质提供多种作用位点，与被分析物之间存在氢键、π π、 偶极 偶极、离子对和包结等相互作用，有利于在正相、反相和极性有机模式下拆分更广泛的手性药物[15]。靛红（Isatin）是中草药青黛中的有效成分之一，具有抗衰老、降血脂、神经元保护和杀菌消炎等多种药理作用[16]。其分子结构中的吲哚醌具有较大的平面共轭π电子体系和极性的羰基、胺基，本研究合成了靛红单取代衍生化βCD手性选择配体，期望改善环糊精端口的疏水性，有利于溶质进入腔体被包结，并提高反相色谱性能，通过增加多种协同作用位点来提高手性和非手性分离的选择性及分离范围，实现一柱多能。色谱传质过程应该是一种有序的运动，除配体的选择外，固定相键合基质也在建立快速手性分离方法中扮演着重要的角色。介孔材料由于具有较大的比表面积、孔径均一可调、形貌可控、表面易修饰和传质阻力小等优点[17]，近年来被视为一类具有发展潜力的性能优异的色谱填料。基于过去的研究工作[18]，本研究将合成的靛红衍生化βCD配体键合到有序的介孔材料SBA 15上，制备出一种新型的靛红衍生化β环糊精键合SBA 15液相色谱固定相（ISCDP），合成路线见图1，在结构表征的基础上，评价了新型色谱柱的色谱性能，期望新固定相不仅具有非手性溶质的反相色谱分离能力，同时也有一定的对映体快速拆分能力。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
高效液相色谱仪包括LC 6A高压泵、SPD 6AV紫外 可见光检测器（日本Shimadzu公司）和N 2000双通道色谱工作站（浙江大学智能信息工程研究所），配有Rheodyne公司7725型手动进样器。ZQ 4000/2695型液相色谱 质谱联用仪（美国Waters公司）；VarioEL Ⅲ型元素分析仪（德国Elementar公司）；5700型FT IR红外光谱仪（美国Nicolet公司）；Diamond TG/DTA 同步热分析仪（美国Perkin Elmer公司）；JSM 6701F型冷场发射扫描电子显微镜，JEM 2100型透射电子显微镜（日本JEOL公司）；XRD DI SYSTEM 多功能X 射线衍射仪（英国Bede公司）；BK224T 12比表面积测试仪（北京精微高博科学技术有限公司）；KQ 100E型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
美托洛尔、阿替洛尔、丹磺酰 亮氨酸、丹磺酰 氨基辛酸等外消旋体化合物及β环糊精均购于Sigma公司，β环糊精用热水重结晶两次。三嵌段聚合物P123（PEO20PPO70PEO20，MW ～5800，Aldrich公司）；3 异氰酸丙基三乙氧基硅烷 （英国Alfa Aesar公司）；正硅酸乙酯（TEOS）、均三甲基苯（TMB）、对甲苯磺酰氯（分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司）；5 氟尿嘧啶（5 Fu）、5 氯尿嘧啶（5 Clu）、5 溴尿嘧啶（5 Bru）、5 碘尿嘧啶（5 Iu）购于中国科学院上海生物化学研究所；硝基苯胺、氨基酚和苯二酚的位置异构体（分析纯，上海阿拉丁试剂）；吡啶（分析纯，上海精析化工科技有限公司），使用前用氢化钙除水；浓HCl、丙酮、DMF、冰醋酸、三乙胺和乙二胺（分析纯，上海化学试剂一厂），DMF用氢化钙除水并减压重蒸一次，三乙胺及乙二胺使用前经二次蒸馏处理；乙腈（ACN）和甲醇（MeOH）为色谱淋洗剂（美国Tedia有限公司）；二次蒸馏水，其他试剂均为分析纯。
2.2 实验方法
2.2.1 6 乙二胺基β环糊精的合成 参照文献＼[19]的方法合成6 乙二胺基β环糊精。在500 mL三颈烧瓶中加入300 mL水和60 gβCD，搅拌下滴加20 mL 8.25 mol/L NaOH，待环糊精完全溶解后，继续搅拌1 h，然后逐滴加入对甲苯磺酰氯的乙腈溶液（10.10 g对甲苯磺酰氯溶于30 mL乙腈中），继续搅拌约2.5 h，过滤，滤液调至pH 8， 4℃下过夜冷却，析出大量白色固体，所得固体用二次蒸馏水重结晶，50℃真空干燥6 h，得7.25 g 6 氧 对甲苯磺酰化β环糊精，产率10.6%。ESI质谱（m/z）测得＼[M+Na]+1402.61 （1402.37），＼[M H]
Symbolm@@ 1287.08 （1287.37），括号中的数据为理论值。
称取6.0 g 6 氧 对甲苯磺酰化β环糊精于圆底烧瓶中，加入90 mL新蒸过的乙二胺， 在80 ℃下搅拌反应4 h， 然后减压蒸除溶剂。将固体溶于少量的热水中，搅拌下加入丙酮 水溶液（10∶1，V/V），收集白色沉淀，并重复上述操作3次，40 ℃真空干燥后得3.65 g 6 乙二胺基β环糊精，该步反应产率为66.1%。分子式C44H76O34N2，ESI质谱（m/z）测得＼[M+H]+m/z1177.57 （1177.43），＼[M-H]
Symbolm@@ m/z1175.53 （1175.42），与理论值相符。
2.2.2 单取代靛红衍生化环糊精配体的合成 称取3.0 g 上述合成的6 乙二胺基βCD固体和0.40 g干燥的靛红于250 mL圆底三颈烧瓶中，加入100 mL无水DMF，搅拌至溶解，在80 ℃下氮气保护反应2 h， 减压蒸除大部分DMF，加入适量的丙酮后析出沉淀，反复用丙酮洗涤产物，50 ℃真空干燥后得到2.83 g单取代靛红衍生化环糊精配体， 产率为85%。分子式C52H79O35N3，元素分析（ %，理论值） ： C 47.24 （47.82），H 6.23 （6.10），N 3.38 （3.22），与理论值相符合。IR （KBr）数据：3417.39 cmSymbolm@@ m/z1304.56 （1304.44），与理论值相符，表明成功合成了靛红单取代衍生化β环糊精配体。
2.2.3 SBA 15的制备 参考＼[20]报道的SBA 15制备方法，本实验以均三甲基苯（TMB）为扩孔剂，在适当的条件下制备得到较大孔径（14.01 nm）的有序介孔SBA 15材料[21]。过程简述如下：加入8.0 g P123、208 mL水和40 mL 36.5% HCl于500 mL圆底烧瓶中，搅拌溶解直至得到透明溶液。接着向溶液中加入17.2 g TEOS和8.0 g TMB，35 ℃下搅拌24 h，投料摩尔比为：n（TEOS）∶n（P123）∶n（HCl）∶
n（TMB）∶n（H2O）=1∶0.017∶5.6∶0.81∶140。 然后将反应物转入聚四氟乙烯内衬自压水热反应釜中，放于100 ℃下的烘箱中静态反应3天，收集白色沉淀，用二次水反复洗涤，空气中凉干，最后白色固体在550 ℃下煅烧8 h，除去有机物，即得到介孔SBA 15产物3.8 g，产率约为76.7%。用3 mol/L HCl浸泡SBA 15，洗涤至中性，并在160 ℃下除水活化6 h，放入干燥器中备用。采用XRD衍射、扫描电镜、透射电镜、比表面测定仪等对其有序性、形貌及孔径分布进行必要的表征。
2.2.4 键合相的制备 制备技术路线见图1。称取0.6 g 靛红衍生化βCD配体溶于20 mL无水吡啶，低温氮气保护下加入0.2 mL 3 异氰酸丙基三乙氧基硅烷，搅拌30 min，升温至70 ℃，继续反应2 h； 加入3.0 g上述合成的SBA 15，氮气保护下升温至105 ℃反应过夜，冷至室温后过滤，依次用吡啶、甲醇、水、丙酮反复洗涤，直至滤液无色清亮，在50 ℃下真空干燥过夜，得到靛红衍生化βCD键合硅胶固定相（ISCDP）。
2.3 色谱柱的填装 采用匀浆装柱法，由于SBA 15固定相密度较小，一般称取SBA 15固定相1.5～2.0 g即可，以丙酮作为匀浆剂，甲醇为顶替液，用一台LC 6A 泵恒压下将固定相匀浆液压入一根不锈钢（150 mm × 4.6 mm）柱中，装柱压力25 MPa，装柱时间约40 min。
2.4 色谱条件 样品用甲醇溶解， 配制成浓度为1 mg/mL的标准储备溶液，实验过程中用流动相稀释至所需浓度20～100 g/L。反相色谱流动相由不同体积比的甲醇和水组成，临用前过滤并超声脱气处理。实验表明，SBA 15柱的柱压约为常规柱的1/2，但考虑到手性分离，流量一般设为0.5 mL/min。溶质的检测波长与样品的光谱性质相关，紫外检测波长在200～300 nm之间。柱温为25 ℃，进样量一般为5 μL。以溶剂峰的保留时间作为死时间（tM），所有样品至少重复测定两次。
3 结果与讨论
3.1 SBA 15的制备与表征
SBA 15是一种具有高有序度六方相的介孔材料，具有较大的比表面积，有序可调的孔结构，较厚的孔壁厚，较高的水热稳定性和机械强度，有利于提高键合量和分离效率。本研究参考文献＼[17，20]有关SBA 15的制备方法，经适当改进后制备得到有一定分散性的类球形SBA 15颗粒 （图2a），以更好满足色谱固定相的需要。XRD （图2b）中观察到一个X衍射峰（100）出现在2θ=0.67附近，但高次衍射峰不明显，说明制备的SBA 15不属于长程的有序结构，推测为单维六角直通孔道结构。图2c为SBA 15的氮气吸附 脱附等温线，显示等温线属于IV型，测得比表面积为465 m2/g，BJH计算出平均孔径达14.01 nm（图2d）。SBA 15 的透射电镜影像也进一步证实SBA 15有序的孔结构（图3）。
3.2 键合相的结构表征
3.2.1 傅里叶变换红外光谱 从新固定相（ISCDP）的红外光谱图（图4）可见，3402.45 cm
Symbolm@@ 1的宽峰归因于环糊精上的羟基和残存的硅羟基的伸缩振动吸收，2982.73， 2931.87和2886.66 cm
Symbolm@@ 1是CH不对称与对称伸缩振动吸收峰，表明在硅胶表面存在有机物。1651.02 cm
附近为SiOSi的振动吸收峰，通过以上信息可推测硅胶表面含有靛红衍生化βCD配体。
3.2.2 元素分析 固定相ISCDP的元素分析结果（%）：C 3.63%，H 0.85% ，N 0.30%。根据碳的百分含量计算得到配体的键合浓度约为0.13 μmol/m2。
3.2.3 热重分析
热重分析测得固定相（ISCDP）失重率为7.8% （从室温升至800 ℃，10 ℃/min）。实验表明，
3.3 键合相ISCDP的基本色谱性能评价
3.3.1 柱效的测定 以联苯为溶质探针，ISCDP为分析柱，甲醇 水（50∶50，V/V）为流动相，流速为0.5 mL/min， 温度为25 ℃，检测波长为254 nm，测得联苯保留时间为19.16 min，计算得到理论塔板数为14931 m
Symbolm@@ 1。联苯在该柱上有较长的保留时间，表明靛红修饰的环糊精固定相有一定的疏水性。
3.3.2 ISCDP分离嘧啶类极性化合物 卤化尿嘧啶（Uracil）是常用的抗癌药物，如5 氟尿嘧啶。由于极性强在反相C18柱上保留很弱，一般不易分离尿嘧啶及其衍生物。从图5可见，在很短的时间内（<7 min），4种卤化尿嘧啶在ISCDP柱上被完全分离，
保留顺序为5 Fu<5 Clu< 5 Bru<5 Iu。同时，随着甲醇含量的升高， 图4 ISCDP的红外光谱图
0.8 mL/min；λ=254 nm.溶质的保留因子对数值（logk′）变小，说明疏水作用和π π作用对上述分离有重要的贡献，ISCDP属一种反相色谱填料。一方面随着F， Cl， Br， I的取代溶质分子量增大，疏水性增加，保留时间变长；另一方面随原子半径的逐渐增大，电子云变形性逐渐增强，有利于增大嘧啶环上的电子云密度，这样与靛红配体平面芳环体系间的π π作用增强，4种卤代尿嘧啶具有不同的保留，5 碘尿嘧啶（5 Iu）的保留时间最长，达到彼此分离的目标。明显地，靛红修饰到环糊精的端口，可增强新固定相的疏水性，改善并提高环糊精类固定相的反相色谱性能。多种相互作用力可以使配体能更好地识别疏水性相近的嘧啶类碱性化合物，分析时间短，且所用流动相简单。在相同条件下，不含靛红的裸β环糊精柱分离上述4种嘧啶类化合物非常困难。
3.3.3 ISCDP分离位置异构体 在反相色谱条件下， 通过考察3组极性基取代苯位置异构体（o，m，p 硝基苯胺、o，m，p 氨基酚，o，m，p苯二酚）在ISCDP上的色谱行为，表征新固定相的立体选择性，分离结果见图6。采用简单的甲醇 水为流动相，3组位置异构体得到了良好分离，表明靛红衍生化β环糊精配体对上述溶质表现出较高的立体选择性。异构体在ISCDP上的保留顺序与它们的疏水性大小不一致，例如邻位异构体通常易形成分子内氢键，疏水性较强，在反相色谱中按理应最后被洗脱，实际上首先被洗脱，对位异构体的保留反而最强，这是由于对位异构体分子呈线性，进入环糊精空腔的几率和深度较大，保留较强，在邻位和间位异构体之后出峰，表明环糊精腔体对溶质的包结作用对分离有重要贡献。从图6a可见，对硝基苯胺的保留远比其它异构体长，硝基是吸电子取代基，使苯环上的电子密度下降，作为电子的接受体，易与富电子的靛红芳环间产生π π和电荷转移作用，这种作用的引导，使对位异构体更易进入环糊精腔体。另外，也存在氢键作用，例如邻位异构体总是在间位异构体之前被洗脱，这是因为邻位异构体结构中存在较强的分子内氢键，因而它的氨基或羟基一般不易与环糊精羟基或靛红羰基形成分子间氢键，这样与固定相作用力相对较弱。综上可知，在反相色谱条件下，多种协同作用使得ISCDP能较好地分离疏水性相差不大的芳烃位置异构体，从而表现出良好的立体选择性。
为研究流动相组成对异构体分离的影响，考察了流动相中有机相浓度（甲醇含量）与上述化合物的保留因子对数（logk'）之间的关系，结果表明，随甲醇含量的提高，溶质的logk'值逐渐减小，说明疏水作用始终存在，这相应于ISCDP的反相色谱本质，多种作用力的存在有利于提高分离选择性。
3.3.4β受体阻滞剂对映体的拆分
衍生化环糊精类固定相是一类典型的手性固定相，目前衍生方式主要基于环糊精端口羟基的烷基化、酰基化和氨基甲酸酯化，通过引入多种位点可提高手性分离选择性。衍生产物包括全衍生化、部分衍生化和不确定取代度的衍生化，已在气相色谱、液相色谱和毛细管电泳中得到广泛应用[22]。本研究将靛红与乙二胺基β环糊精形成Schiff碱的方式进行修饰，形成6 位上的单取代衍生物，该衍生物作为配体有确定的组成和稳定的色谱性能。乙二胺间隔基有利于增强靛红的柔性，从而使靛红基和β环糊精能协同识别手性客体。
美托洛尔、阿替洛尔是两种常用的治疗心脑血管疾病的β受体阻滞剂，手性碳位于氨基丙醇结构（图7）。目前拆分这类手性药物较困难，成功拆分的例子基本上是采用商品化的3，5 二甲基苯氨基甲酸酯衍生化纤维素和替考拉宁大环抗生素手性柱。本研究设计的单取代的靛红衍生化β环糊精键合SBA 15固定相在常温下能快速拆分上述对映体，分析时间明显缩短（<20 min），分离度可达1.30（图8），自制的手性柱成本大大降低，效率却得到了提高。先采用常见的反相色谱来拆分β受体阻滞剂，典型的流动相为甲醇 1%醋酸三乙铵盐（TEAA， pH 3.5～5.5），发现分离度较差，条件优化存在困难。为此，重点考察了ISCDP柱在极性有机模式下的美托洛尔和阿替洛尔手性色谱性能，取得了较好的分离效果。在极性有机溶剂模式下，流动相中不含水，由乙腈/甲醇/冰醋酸/三乙胺共同组成。实验表明，自制的手性柱压力较低，流动相流速适用范围宽，但考虑手性分离和方法实用性，将流速设为0.5 mL/min，分离在室温下进行，在此条件下对流动相的组成进行了一定的优化，拆分美托洛尔的条件为：乙腈/甲醇/冰醋酸/三乙胺（98∶2∶0.5∶0.5，V/V）；拆分阿替洛尔的条件为：乙腈/甲醇/冰醋酸/三乙胺（96∶4∶0.1∶0.4，V/V）。
实验发现，流动相乙腈和甲醇含量的提高对溶质的保留影响相反。随乙腈含量的提高，美托洛尔和阿替洛尔的手性对映体分离度均有所增大，但保留时间迅速变长，甚至无法被洗脱；增加甲醇的含量却相反，峰变窄和对称，但分离度对甲醇含量的变化较敏感。明显地，高含量的乙腈为流动相，溶质的疏水性不是重要因素，氢键作用更加显现。例如甲醇是氢键给体，它会与环糊精共同竞争溶质，从而减弱了固定相与溶质间的氢键作用，溶质保留时间变短，不利于对映体的拆分，因此对甲醇含量进行了微调。尽管两溶质手性碳的基本结构相同，但阿替洛尔含酰胺基，氢键作用较强，适用的甲醇含量较高（4%）。实验也表明，流动相中醋酸和三乙胺的含量和配比对手性分离至关重要，含量升高，溶质保留时间缩短，但分离度是先增加后降低，浓度不宜太高。阿替洛尔的行为与美托洛尔不同，醋酸和三乙胺（0.1∶0.4，V/V）反而分得更好。上述行为可能是因为醋酸对碱性药物的适量质子化有利于环糊精端口或靛红基接近手性碳，达到有效手性识别；另一方面，三乙胺可减小固定相上残存硅醇羟基对碱性药物的影响，降低拖尾，改善峰形，由阿替洛尔含酰胺基手性分离时需要更多三乙胺。在优化的条件下，裸β环糊精柱对上述溶质分离需要40～50 min，且分离度较差，说明靛红衍生基团对上述手性分离有重要贡献。
3.3.5 丹磺酰化氨基酸对映体的拆分 氨基酸是蛋白质的重要构件，早期采用薄层色谱测定， 随着高效液相色谱的快速发展，氨基酸自动分析系统己得到了广泛的应用，但主要限于非手性分离分析。本研究将靛红衍生化β环糊精柱用于丹磺酰 氨基酸对映体的拆分，在常用的反相色谱模式下，分别考察了新柱对丹磺酰亮氨酸及丹磺酰 亮氨酸的对映体拆分能力。两种丹磺酰化氨基酸的化学结构（图7），它们的对映体在ISCDP上得到了良好的分离。适用的流动相组成为甲醇 1% TEAA （50∶50， pH 5.1），两种衍生化的手性氨基酸对映体取得接近基线的分离效果，分析时间也较短（<15 min， 图9）。
上述实验表明，ISCDP在反相色谱条件下，也有较强的手性分离能力，即使甲醇含量高达50%，溶质仍有较强的保留，暗示靛红基团的引入可增强环糊精端口的疏水性，改善反相色谱性能。另外，靛红的平面芳环结构与丹磺酰基的萘环间存在较强的π π作用，使氨基酸的手性中心更容易接近环糊精的端口，多作用协同使氨基酸在ISCDP固定相达到了基线分离，实现快速分离分析。两种氨基酸的侧链（异丙基和正己基）疏水性有一定的不同，可是两者的保留时间和分离度接近，暗示着在反相色谱中除疏水作用外，靛红衍生化环糊精配体对手性碳附近取代基的部分包结作用力有可能掩盖两者疏水性的差异。因此，新固定相的多种作用位点在手性和非手性分离中具有一定的应用优势。4 结 论
靛红衍生化的环糊精固定相不仅可以较好地分离非手性化合物，还可以分离位置异构体和对映异构体。引入靛红基可改善了环糊精配体与溶质间的疏水作用，使固定相的反相色谱性能有所提高；同时还可为溶质提供多种作用位点，使溶质更容易接近环糊精的腔体和端口，协同作用有利于提高其手性选择能力。此外，将新型配体键合到具有直通孔的SBA 15的通道内壁上，配体能快速与溶质相互作用，传质阻力较小，峰展宽小，使分离速度得到提高。
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22 Ward T J， Baker B A.Anal. Chem.， 2008， 80（12）： 4363-4372
摘 要 利用靛红的羰基与β环糊精单取代乙二胺的缩合反应，合成得到一种靛红衍生化β环糊精Schiff碱类化合物。以3 异氰酸丙基三乙氧基硅烷为偶联剂，将其键合到自制的有序介孔二氧化硅材料SBA 15表面，制得一种新型的靛红衍生化β环糊精键合SBA 15液相色谱固定相（ISCDP）。分别对β环糊精衍生物、SBA 15及固定相进行必要的结构表征。在反相色谱条件下，以卤代尿嘧啶类极性化合物和二取代苯位置异构体为探针，评价新固定相的基本色谱性能。在极性有机溶剂和反相模式下，将新固定相分别用于β受体阻滞剂药物和丹磺酰化氨基酸对映体的拆分，探讨了相关色谱分离机理。实验表明，靛红吲哚环的引入，增强了环糊精类固定相对卤代尿嘧啶的反相色谱分离能力，分析时间小于7 min。固定相分离硝基苯胺、氨基苯酚和苯二酚的位置异构体时也表现出较高的立体选择性，其中对位异构体均最后被洗脱，这与包结作用相关；靛红衍生化β环糊精配体也提高了固定相的手性分离能力，除疏水作用外，靛红衍生化β环糊精配体还能提供偶极、氢键、π π和包结等作用，多种协同作用力有利于提高新固定相的手性和非手性分离的选择性。SBA 15作为键合基质，其有序的孔结构有利于保持色谱柱的良好渗透性和小的传质阻力，在快速高效分离分析中具有应用潜能。
关键词 高效液相色谱法；靛红衍生化β环糊精键合相；SBA 15；手性和非手性分离机理
1 引 言
β受体阻滞剂是一类用于治疗高血压和心绞痛的手性药物，其对映体的药理、药代动力学和毒理等差异较大。通常，S 构型药物比R构型临床疗效高（约100倍），部分对映体存在拮抗和毒性[1]。因此，建立准确、高效、快速的手性分离方法，对食品安全、有效的药物质量监控和对映体药代动力学研究都具有重要意义[2]。
高效液相色谱（HPLC）由于选择性好、分离效率高、色谱条件温和、样品兼容性好，仪器日趋成熟等特点，已发展成为手性药物对映体拆分和含量测定的首选方法之一[3，4]。由于对映体的性质极其相似，发展选择性高和柱性能优越的固定相是手性药物分离与研究中的重要课题之一。β受体阻滞剂的对映体拆分涉及到常见的手性固定相（CSPs），如刷型、大环抗生素类、合成或半合成聚合物类、蛋白质类和分子印迹类等[5～11]，以纤维素类和大环抗生素类商品手性柱的报道居多，手性分离时间一般需要20～50 min。 2012年，Morante Zarcero等[9]比较了4根纤维素和大环抗生素商品柱 （Chiralpak AD H， Lux Cellulose 1， Chirobiotic T， Sumichiral OA 4900） 在极性有机和正相色谱模式下对普萘洛尔、美托洛尔、阿替洛尔和吲哚洛尔的手性拆分能力，研究表明， Chirobiotic T是唯一能完全拆分4种洛尔对映体的色谱柱。丁国生等[10]制备了去甲万古霉素固定相，在极性模式下成功拆分了普萘洛尔、美托洛尔、阿替洛尔和烯丙洛尔。李芳等[11]采用直链淀粉商品柱ChiralPak AD H拆分了比索洛尔对映体，考察了流动相的组成、流速及柱温对分离的影响。 叶金星等[12]采用新型的全苯基化环糊精商品手性柱（Shiseido CD Ph），以乙腈 0.5 mol/L NaClO4（60∶40，V/V， pH 4.0）为流动相，拆分了3种常见的洛尔类手性药物对映体。
环糊精（Cyclodextrins，CD）是由D吡喃葡萄糖单元通过α 1，4 糖苷键连接而成的环状分子，含多个手性碳原子，具有疏水性的空腔和腔外亲水性的羟基结构，在手性分离方面极具应用潜力。Armstrong等[13，14]用环氧基偶联剂与βCD开环反应，首次制备了醚键连接的稳定的βCD键合手性固定相，之后分别经异氰酸酯基和酰基改性，这类固定相能为溶质提供多种作用位点，与被分析物之间存在氢键、π π、 偶极 偶极、离子对和包结等相互作用，有利于在正相、反相和极性有机模式下拆分更广泛的手性药物[15]。靛红（Isatin）是中草药青黛中的有效成分之一，具有抗衰老、降血脂、神经元保护和杀菌消炎等多种药理作用[16]。其分子结构中的吲哚醌具有较大的平面共轭π电子体系和极性的羰基、胺基，本研究合成了靛红单取代衍生化βCD手性选择配体，期望改善环糊精端口的疏水性，有利于溶质进入腔体被包结，并提高反相色谱性能，通过增加多种协同作用位点来提高手性和非手性分离的选择性及分离范围，实现一柱多能。色谱传质过程应该是一种有序的运动，除配体的选择外，固定相键合基质也在建立快速手性分离方法中扮演着重要的角色。介孔材料由于具有较大的比表面积、孔径均一可调、形貌可控、表面易修饰和传质阻力小等优点[17]，近年来被视为一类具有发展潜力的性能优异的色谱填料。基于过去的研究工作[18]，本研究将合成的靛红衍生化βCD配体键合到有序的介孔材料SBA 15上，制备出一种新型的靛红衍生化β环糊精键合SBA 15液相色谱固定相（ISCDP），合成路线见图1，在结构表征的基础上，评价了新型色谱柱的色谱性能，期望新固定相不仅具有非手性溶质的反相色谱分离能力，同时也有一定的对映体快速拆分能力。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
高效液相色谱仪包括LC 6A高压泵、SPD 6AV紫外 可见光检测器（日本Shimadzu公司）和N 2000双通道色谱工作站（浙江大学智能信息工程研究所），配有Rheodyne公司7725型手动进样器。ZQ 4000/2695型液相色谱 质谱联用仪（美国Waters公司）；VarioEL Ⅲ型元素分析仪（德国Elementar公司）；5700型FT IR红外光谱仪（美国Nicolet公司）；Diamond TG/DTA 同步热分析仪（美国Perkin Elmer公司）；JSM 6701F型冷场发射扫描电子显微镜，JEM 2100型透射电子显微镜（日本JEOL公司）；XRD DI SYSTEM 多功能X 射线衍射仪（英国Bede公司）；BK224T 12比表面积测试仪（北京精微高博科学技术有限公司）；KQ 100E型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
美托洛尔、阿替洛尔、丹磺酰 亮氨酸、丹磺酰 氨基辛酸等外消旋体化合物及β环糊精均购于Sigma公司，β环糊精用热水重结晶两次。三嵌段聚合物P123（PEO20PPO70PEO20，MW ～5800，Aldrich公司）；3 异氰酸丙基三乙氧基硅烷 （英国Alfa Aesar公司）；正硅酸乙酯（TEOS）、均三甲基苯（TMB）、对甲苯磺酰氯（分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司）；5 氟尿嘧啶（5 Fu）、5 氯尿嘧啶（5 Clu）、5 溴尿嘧啶（5 Bru）、5 碘尿嘧啶（5 Iu）购于中国科学院上海生物化学研究所；硝基苯胺、氨基酚和苯二酚的位置异构体（分析纯，上海阿拉丁试剂）；吡啶（分析纯，上海精析化工科技有限公司），使用前用氢化钙除水；浓HCl、丙酮、DMF、冰醋酸、三乙胺和乙二胺（分析纯，上海化学试剂一厂），DMF用氢化钙除水并减压重蒸一次，三乙胺及乙二胺使用前经二次蒸馏处理；乙腈（ACN）和甲醇（MeOH）为色谱淋洗剂（美国Tedia有限公司）；二次蒸馏水，其他试剂均为分析纯。
2.2 实验方法
2.2.1 6 乙二胺基β环糊精的合成 参照文献＼[19]的方法合成6 乙二胺基β环糊精。在500 mL三颈烧瓶中加入300 mL水和60 gβCD，搅拌下滴加20 mL 8.25 mol/L NaOH，待环糊精完全溶解后，继续搅拌1 h，然后逐滴加入对甲苯磺酰氯的乙腈溶液（10.10 g对甲苯磺酰氯溶于30 mL乙腈中），继续搅拌约2.5 h，过滤，滤液调至pH 8， 4℃下过夜冷却，析出大量白色固体，所得固体用二次蒸馏水重结晶，50℃真空干燥6 h，得7.25 g 6 氧 对甲苯磺酰化β环糊精，产率10.6%。ESI质谱（m/z）测得＼[M+Na]+1402.61 （1402.37），＼[M H]
Symbolm@@ 1287.08 （1287.37），括号中的数据为理论值。
称取6.0 g 6 氧 对甲苯磺酰化β环糊精于圆底烧瓶中，加入90 mL新蒸过的乙二胺， 在80 ℃下搅拌反应4 h， 然后减压蒸除溶剂。将固体溶于少量的热水中，搅拌下加入丙酮 水溶液（10∶1，V/V），收集白色沉淀，并重复上述操作3次，40 ℃真空干燥后得3.65 g 6 乙二胺基β环糊精，该步反应产率为66.1%。分子式C44H76O34N2，ESI质谱（m/z）测得＼[M+H]+m/z1177.57 （1177.43），＼[M-H]
Symbolm@@ m/z1175.53 （1175.42），与理论值相符。
2.2.2 单取代靛红衍生化环糊精配体的合成 称取3.0 g 上述合成的6 乙二胺基βCD固体和0.40 g干燥的靛红于250 mL圆底三颈烧瓶中，加入100 mL无水DMF，搅拌至溶解，在80 ℃下氮气保护反应2 h， 减压蒸除大部分DMF，加入适量的丙酮后析出沉淀，反复用丙酮洗涤产物，50 ℃真空干燥后得到2.83 g单取代靛红衍生化环糊精配体， 产率为85%。分子式C52H79O35N3，元素分析（ %，理论值） ： C 47.24 （47.82），H 6.23 （6.10），N 3.38 （3.22），与理论值相符合。IR （KBr）数据：3417.39 cmSymbolm@@ m/z1304.56 （1304.44），与理论值相符，表明成功合成了靛红单取代衍生化β环糊精配体。
2.2.3 SBA 15的制备 参考＼[20]报道的SBA 15制备方法，本实验以均三甲基苯（TMB）为扩孔剂，在适当的条件下制备得到较大孔径（14.01 nm）的有序介孔SBA 15材料[21]。过程简述如下：加入8.0 g P123、208 mL水和40 mL 36.5% HCl于500 mL圆底烧瓶中，搅拌溶解直至得到透明溶液。接着向溶液中加入17.2 g TEOS和8.0 g TMB，35 ℃下搅拌24 h，投料摩尔比为：n（TEOS）∶n（P123）∶n（HCl）∶
n（TMB）∶n（H2O）=1∶0.017∶5.6∶0.81∶140。 然后将反应物转入聚四氟乙烯内衬自压水热反应釜中，放于100 ℃下的烘箱中静态反应3天，收集白色沉淀，用二次水反复洗涤，空气中凉干，最后白色固体在550 ℃下煅烧8 h，除去有机物，即得到介孔SBA 15产物3.8 g，产率约为76.7%。用3 mol/L HCl浸泡SBA 15，洗涤至中性，并在160 ℃下除水活化6 h，放入干燥器中备用。采用XRD衍射、扫描电镜、透射电镜、比表面测定仪等对其有序性、形貌及孔径分布进行必要的表征。
2.2.4 键合相的制备 制备技术路线见图1。称取0.6 g 靛红衍生化βCD配体溶于20 mL无水吡啶，低温氮气保护下加入0.2 mL 3 异氰酸丙基三乙氧基硅烷，搅拌30 min，升温至70 ℃，继续反应2 h； 加入3.0 g上述合成的SBA 15，氮气保护下升温至105 ℃反应过夜，冷至室温后过滤，依次用吡啶、甲醇、水、丙酮反复洗涤，直至滤液无色清亮，在50 ℃下真空干燥过夜，得到靛红衍生化βCD键合硅胶固定相（ISCDP）。
2.3 色谱柱的填装 采用匀浆装柱法，由于SBA 15固定相密度较小，一般称取SBA 15固定相1.5～2.0 g即可，以丙酮作为匀浆剂，甲醇为顶替液，用一台LC 6A 泵恒压下将固定相匀浆液压入一根不锈钢（150 mm × 4.6 mm）柱中，装柱压力25 MPa，装柱时间约40 min。
2.4 色谱条件 样品用甲醇溶解， 配制成浓度为1 mg/mL的标准储备溶液，实验过程中用流动相稀释至所需浓度20～100 g/L。反相色谱流动相由不同体积比的甲醇和水组成，临用前过滤并超声脱气处理。实验表明，SBA 15柱的柱压约为常规柱的1/2，但考虑到手性分离，流量一般设为0.5 mL/min。溶质的检测波长与样品的光谱性质相关，紫外检测波长在200～300 nm之间。柱温为25 ℃，进样量一般为5 μL。以溶剂峰的保留时间作为死时间（tM），所有样品至少重复测定两次。
3 结果与讨论
3.1 SBA 15的制备与表征
SBA 15是一种具有高有序度六方相的介孔材料，具有较大的比表面积，有序可调的孔结构，较厚的孔壁厚，较高的水热稳定性和机械强度，有利于提高键合量和分离效率。本研究参考文献＼[17，20]有关SBA 15的制备方法，经适当改进后制备得到有一定分散性的类球形SBA 15颗粒 （图2a），以更好满足色谱固定相的需要。XRD （图2b）中观察到一个X衍射峰（100）出现在2θ=0.67附近，但高次衍射峰不明显，说明制备的SBA 15不属于长程的有序结构，推测为单维六角直通孔道结构。图2c为SBA 15的氮气吸附 脱附等温线，显示等温线属于IV型，测得比表面积为465 m2/g，BJH计算出平均孔径达14.01 nm（图2d）。SBA 15 的透射电镜影像也进一步证实SBA 15有序的孔结构（图3）。
3.2 键合相的结构表征
3.2.1 傅里叶变换红外光谱 从新固定相（ISCDP）的红外光谱图（图4）可见，3402.45 cm
Symbolm@@ 1的宽峰归因于环糊精上的羟基和残存的硅羟基的伸缩振动吸收，2982.73， 2931.87和2886.66 cm
Symbolm@@ 1是CH不对称与对称伸缩振动吸收峰，表明在硅胶表面存在有机物。1651.02 cm
附近为SiOSi的振动吸收峰，通过以上信息可推测硅胶表面含有靛红衍生化βCD配体。
3.2.2 元素分析 固定相ISCDP的元素分析结果（%）：C 3.63%，H 0.85% ，N 0.30%。根据碳的百分含量计算得到配体的键合浓度约为0.13 μmol/m2。
3.2.3 热重分析
热重分析测得固定相（ISCDP）失重率为7.8% （从室温升至800 ℃，10 ℃/min）。实验表明，
3.3 键合相ISCDP的基本色谱性能评价
3.3.1 柱效的测定 以联苯为溶质探针，ISCDP为分析柱，甲醇 水（50∶50，V/V）为流动相，流速为0.5 mL/min， 温度为25 ℃，检测波长为254 nm，测得联苯保留时间为19.16 min，计算得到理论塔板数为14931 m
Symbolm@@ 1。联苯在该柱上有较长的保留时间，表明靛红修饰的环糊精固定相有一定的疏水性。
3.3.2 ISCDP分离嘧啶类极性化合物 卤化尿嘧啶（Uracil）是常用的抗癌药物，如5 氟尿嘧啶。由于极性强在反相C18柱上保留很弱，一般不易分离尿嘧啶及其衍生物。从图5可见，在很短的时间内（<7 min），4种卤化尿嘧啶在ISCDP柱上被完全分离，
保留顺序为5 Fu<5 Clu< 5 Bru<5 Iu。同时，随着甲醇含量的升高， 图4 ISCDP的红外光谱图
0.8 mL/min；λ=254 nm.溶质的保留因子对数值（logk′）变小，说明疏水作用和π π作用对上述分离有重要的贡献，ISCDP属一种反相色谱填料。一方面随着F， Cl， Br， I的取代溶质分子量增大，疏水性增加，保留时间变长；另一方面随原子半径的逐渐增大，电子云变形性逐渐增强，有利于增大嘧啶环上的电子云密度，这样与靛红配体平面芳环体系间的π π作用增强，4种卤代尿嘧啶具有不同的保留，5 碘尿嘧啶（5 Iu）的保留时间最长，达到彼此分离的目标。明显地，靛红修饰到环糊精的端口，可增强新固定相的疏水性，改善并提高环糊精类固定相的反相色谱性能。多种相互作用力可以使配体能更好地识别疏水性相近的嘧啶类碱性化合物，分析时间短，且所用流动相简单。在相同条件下，不含靛红的裸β环糊精柱分离上述4种嘧啶类化合物非常困难。
3.3.3 ISCDP分离位置异构体 在反相色谱条件下， 通过考察3组极性基取代苯位置异构体（o，m，p 硝基苯胺、o，m，p 氨基酚，o，m，p苯二酚）在ISCDP上的色谱行为，表征新固定相的立体选择性，分离结果见图6。采用简单的甲醇 水为流动相，3组位置异构体得到了良好分离，表明靛红衍生化β环糊精配体对上述溶质表现出较高的立体选择性。异构体在ISCDP上的保留顺序与它们的疏水性大小不一致，例如邻位异构体通常易形成分子内氢键，疏水性较强，在反相色谱中按理应最后被洗脱，实际上首先被洗脱，对位异构体的保留反而最强，这是由于对位异构体分子呈线性，进入环糊精空腔的几率和深度较大，保留较强，在邻位和间位异构体之后出峰，表明环糊精腔体对溶质的包结作用对分离有重要贡献。从图6a可见，对硝基苯胺的保留远比其它异构体长，硝基是吸电子取代基，使苯环上的电子密度下降，作为电子的接受体，易与富电子的靛红芳环间产生π π和电荷转移作用，这种作用的引导，使对位异构体更易进入环糊精腔体。另外，也存在氢键作用，例如邻位异构体总是在间位异构体之前被洗脱，这是因为邻位异构体结构中存在较强的分子内氢键，因而它的氨基或羟基一般不易与环糊精羟基或靛红羰基形成分子间氢键，这样与固定相作用力相对较弱。综上可知，在反相色谱条件下，多种协同作用使得ISCDP能较好地分离疏水性相差不大的芳烃位置异构体，从而表现出良好的立体选择性。
为研究流动相组成对异构体分离的影响，考察了流动相中有机相浓度（甲醇含量）与上述化合物的保留因子对数（logk'）之间的关系，结果表明，随甲醇含量的提高，溶质的logk'值逐渐减小，说明疏水作用始终存在，这相应于ISCDP的反相色谱本质，多种作用力的存在有利于提高分离选择性。
3.3.4β受体阻滞剂对映体的拆分
衍生化环糊精类固定相是一类典型的手性固定相，目前衍生方式主要基于环糊精端口羟基的烷基化、酰基化和氨基甲酸酯化，通过引入多种位点可提高手性分离选择性。衍生产物包括全衍生化、部分衍生化和不确定取代度的衍生化，已在气相色谱、液相色谱和毛细管电泳中得到广泛应用[22]。本研究将靛红与乙二胺基β环糊精形成Schiff碱的方式进行修饰，形成6 位上的单取代衍生物，该衍生物作为配体有确定的组成和稳定的色谱性能。乙二胺间隔基有利于增强靛红的柔性，从而使靛红基和β环糊精能协同识别手性客体。
美托洛尔、阿替洛尔是两种常用的治疗心脑血管疾病的β受体阻滞剂，手性碳位于氨基丙醇结构（图7）。目前拆分这类手性药物较困难，成功拆分的例子基本上是采用商品化的3，5 二甲基苯氨基甲酸酯衍生化纤维素和替考拉宁大环抗生素手性柱。本研究设计的单取代的靛红衍生化β环糊精键合SBA 15固定相在常温下能快速拆分上述对映体，分析时间明显缩短（<20 min），分离度可达1.30（图8），自制的手性柱成本大大降低，效率却得到了提高。先采用常见的反相色谱来拆分β受体阻滞剂，典型的流动相为甲醇 1%醋酸三乙铵盐（TEAA， pH 3.5～5.5），发现分离度较差，条件优化存在困难。为此，重点考察了ISCDP柱在极性有机模式下的美托洛尔和阿替洛尔手性色谱性能，取得了较好的分离效果。在极性有机溶剂模式下，流动相中不含水，由乙腈/甲醇/冰醋酸/三乙胺共同组成。实验表明，自制的手性柱压力较低，流动相流速适用范围宽，但考虑手性分离和方法实用性，将流速设为0.5 mL/min，分离在室温下进行，在此条件下对流动相的组成进行了一定的优化，拆分美托洛尔的条件为：乙腈/甲醇/冰醋酸/三乙胺（98∶2∶0.5∶0.5，V/V）；拆分阿替洛尔的条件为：乙腈/甲醇/冰醋酸/三乙胺（96∶4∶0.1∶0.4，V/V）。
实验发现，流动相乙腈和甲醇含量的提高对溶质的保留影响相反。随乙腈含量的提高，美托洛尔和阿替洛尔的手性对映体分离度均有所增大，但保留时间迅速变长，甚至无法被洗脱；增加甲醇的含量却相反，峰变窄和对称，但分离度对甲醇含量的变化较敏感。明显地，高含量的乙腈为流动相，溶质的疏水性不是重要因素，氢键作用更加显现。例如甲醇是氢键给体，它会与环糊精共同竞争溶质，从而减弱了固定相与溶质间的氢键作用，溶质保留时间变短，不利于对映体的拆分，因此对甲醇含量进行了微调。尽管两溶质手性碳的基本结构相同，但阿替洛尔含酰胺基，氢键作用较强，适用的甲醇含量较高（4%）。实验也表明，流动相中醋酸和三乙胺的含量和配比对手性分离至关重要，含量升高，溶质保留时间缩短，但分离度是先增加后降低，浓度不宜太高。阿替洛尔的行为与美托洛尔不同，醋酸和三乙胺（0.1∶0.4，V/V）反而分得更好。上述行为可能是因为醋酸对碱性药物的适量质子化有利于环糊精端口或靛红基接近手性碳，达到有效手性识别；另一方面，三乙胺可减小固定相上残存硅醇羟基对碱性药物的影响，降低拖尾，改善峰形，由阿替洛尔含酰胺基手性分离时需要更多三乙胺。在优化的条件下，裸β环糊精柱对上述溶质分离需要40～50 min，且分离度较差，说明靛红衍生基团对上述手性分离有重要贡献。
3.3.5 丹磺酰化氨基酸对映体的拆分 氨基酸是蛋白质的重要构件，早期采用薄层色谱测定， 随着高效液相色谱的快速发展，氨基酸自动分析系统己得到了广泛的应用，但主要限于非手性分离分析。本研究将靛红衍生化β环糊精柱用于丹磺酰 氨基酸对映体的拆分，在常用的反相色谱模式下，分别考察了新柱对丹磺酰亮氨酸及丹磺酰 亮氨酸的对映体拆分能力。两种丹磺酰化氨基酸的化学结构（图7），它们的对映体在ISCDP上得到了良好的分离。适用的流动相组成为甲醇 1% TEAA （50∶50， pH 5.1），两种衍生化的手性氨基酸对映体取得接近基线的分离效果，分析时间也较短（<15 min， 图9）。
上述实验表明，ISCDP在反相色谱条件下，也有较强的手性分离能力，即使甲醇含量高达50%，溶质仍有较强的保留，暗示靛红基团的引入可增强环糊精端口的疏水性，改善反相色谱性能。另外，靛红的平面芳环结构与丹磺酰基的萘环间存在较强的π π作用，使氨基酸的手性中心更容易接近环糊精的端口，多作用协同使氨基酸在ISCDP固定相达到了基线分离，实现快速分离分析。两种氨基酸的侧链（异丙基和正己基）疏水性有一定的不同，可是两者的保留时间和分离度接近，暗示着在反相色谱中除疏水作用外，靛红衍生化环糊精配体对手性碳附近取代基的部分包结作用力有可能掩盖两者疏水性的差异。因此，新固定相的多种作用位点在手性和非手性分离中具有一定的应用优势。4 结 论
靛红衍生化的环糊精固定相不仅可以较好地分离非手性化合物，还可以分离位置异构体和对映异构体。引入靛红基可改善了环糊精配体与溶质间的疏水作用，使固定相的反相色谱性能有所提高；同时还可为溶质提供多种作用位点，使溶质更容易接近环糊精的腔体和端口，协同作用有利于提高其手性选择能力。此外，将新型配体键合到具有直通孔的SBA 15的通道内壁上，配体能快速与溶质相互作用，传质阻力较小，峰展宽小，使分离速度得到提高。
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