ATP生物发光法在喷气燃料微生物检测中的应用

    孙新枫 熊云 牛明明

    

    

    摘      要：近年来，由于微生物污染带来的喷气燃料储存和使用问题日渐增多。喷气燃料中微生物的快速检测是有效治理微生物污染的前提。本文采用HY-LiTE? JET A1燃料试验对ATP生物发光法在喷气燃料微生物检测中的应用进行了研究。研究发现，该方法与国标平皿计数方法在一定范围内呈正相关（R2=0.960 1），但也存在振荡标准不统一、萃取液萃取不完全、知识产权受限和耗材昂贵等诸多问题。最后展望了ATP生物发光法和滤膜集菌法未来的发展前景，对研制具有我国自主知识产权的喷气燃料微生物检测设备具有指导意义。

    关  键  词：喷气燃料;微生物;ATP生物发光法;应用

    中图分类号：TE 626.23       文献标识码： A       文章编号： 1671-0460（2019）01-0088-04

    Abstract： In recent years， the storage and usage problems of jet fuel caused by microbial contamination are increasing. Rapid detection of microorganisms in jet fuel is a prerequisite for the effective treatment of microorganisms. In this paper，HY-LiTE? JET A1 fuel test was used to study the application of ATP bioluminescence method in the microbial detection of jet fuel. The results showed this method was positively correlated with the national standard of plate counting method （R2=0.960 1） in a certain range， however there were many problems， such as inconsistent oscillation criteria， incomplete extraction， limited intellectual property rights and expensive materials. The prospects of ATP bioluminescence method and filter membrane method were briefly discussed， which has guiding significance for the development of microorganism detection equipment for jet fuel with independent intellectual property rights.

    Key words： Jet fuel; Microorganisms; ATP bioluminescence method; Application

    ATP生物发光法是一种能够快速检测活体微生物数量的方法，其基本原理[1-3]是荧光素酶（Luciferase）以虫荧光素（Luciferin）、ATP和O2为底物，在Mg2+作用下，将化学能转化为光能。DEustachio[4]和Levin[5]研究发现处于各生长期的微生物，均含有较为稳定的ATP含量。James[6]和Sevin[7，8]研究表明，当ATP含量处在一定浓度范围内，活细胞数与ATP发光值之间存在着良好的线性关系。而当微生物死亡后，在细胞酶的作用下，ATP会很快被分解。因此可用ATP生物发光法来测定活菌数。

    喷气燃料中不可避免的会存在微生物污染，给储存安全和飞行安全带来重大安全隐患[9]。目前国际上尚未形成统一的喷气燃料微生物检测方法。本文通过采用基于ATP生物发光原理的HY-LiTE? JET A1燃料试验对梯度实验、人工振荡效果和振荡器振荡效果进行研究，探究其在现场快速检测的可行性，为建立适合我国的喷气燃料微生物污染评价方法提供新思路。

    1  仪器与试剂

    仪器：HY-LITE2 检测仪器，德国默克公司;萃取液漩涡振荡器X-Vortex和样品混合振荡器X-Oscillator，上海迅捷华智有限公司;恒温培养箱、高压灭菌锅、移液枪（100～1 000μL）、無菌吸管、1L样品瓶。

    试剂：XX油库使用罐储存的3号喷气燃料、沙保仕培养基、5%生理盐水（自配）、局限青霉标准菌液。

    2  实验方法

    2.1  标准菌液计数

    将纯种局限青霉接种于500 mL沙保仕液体培养液中，置30 ℃恒温培养箱中培养48 h，用作标准菌液。以GB 4789.2-2010《食品卫生微生物学检验  菌落总数测定》方法，对该标准菌液进行10倍、100倍及1 000倍梯度稀释并进行培养，测定该菌液中的菌落数。

    2.2  HY-LiTE? JET A1燃料试验的梯度实验验证

    将局限青霉标准菌液用无菌生理盐水分别稀释2倍、5倍、10倍和100倍，稀释倍数与菌落数关系如表1所示。在原液和四个稀释液中分别取1 mL菌液加入到五个装有1 L无菌喷气燃料的样品瓶中，制备成相应稀释倍数的含菌喷气燃料。混合摇匀后，静置5 min。HY-LiTE? JET A1燃料试验的方法步骤如图1所示，对每个稀释度的含菌喷气燃料，各进行两次测量，测定其荧光值，以菌落数（CFU/mL）为X轴，荧光值（RLU）为Y轴，绘制菌落数与荧光值之间的线性关系图。

    2.3  HY-LiTE? JET A1燃料试验的人工振荡实验

    用无菌吸管吸取1 mL标准菌液，加入到HY-LiTE测试笔的萃取液中，静置5 min。待菌液与萃取液混合均匀后，将测试棒取出，将测试棒插入到装有蓝色萃取液的笔管中充分蘸取萃取液，而后将测试棒全部压进笔管中，顺时针旋转测试笔，确保保护膜被捅破，露出黑色。最后将测试笔放入到HY-LITE光度仪中，测定其荧光值，作为1mL菌液的荧光真值。

    取4 L无菌喷气燃料分装在4个样品瓶中，每个样品瓶中分别加入1 mL局限青霉标准菌液，充分摇匀。四名实验员分别为男A、男B、女A和女B，按照HY-LiTE? JET A1燃料试验的方法步骤，严格控制样品瓶摇晃30 s和测试笔振荡20 s的时间限制。每个实验员对一个样品瓶进行微生物检测。记录四名实验员所测的荧光值。

    2.4  振蕩器的振荡效果研究

    为了解决人为振荡标准不统一的问题，上海迅捷华智公司研制了萃取液漩涡振荡器X-Vortex和样品混合振荡器X-Oscillator（见图2），并对转速进行了限定。萃取液漩涡振荡器X-Vortex设定转速在400～700 r/min之间，样品混合振荡器X-Oscillator设定转速在五档。

    在4个含1 L无菌喷气燃料的样品瓶中，分别加入1 mL局限青霉标准菌液，采用人工振荡和振荡器的方法各对两个样品瓶进行测定，测定不同振荡方法的RLU值，对振荡器的振荡效果进行评估。

    3  结果和分析

    3.1  标准菌液计数

    按照GB 4789.2-2010《食品卫生微生物学检验  菌落总数测定》方法，将菌液稀释10倍、100倍和1 000倍，所得稀释液培养皿如图3所示。

    从表2中可以看出，100倍稀释液的菌落数平均值是238 CFU/mL。因此，该局限青霉标准菌液的菌落数大致为2.4×104 CFU/mL。

    3.2  梯度实验效果分析

    在相同的操作条件下，使用HY-LiTE? JET A1燃料试验对不同稀释度的含菌喷气燃料进行检测，所检测荧光值和线性相关图如表3和图4所示。从图4中可以得出，测定的RLU值与喷气燃料中的菌落数的相关系数R2是96.01%，说明了二者之间有着良好的线性相关性。但是从表3中可以看出，不同稀释度菌液燃料测量结果的相对极差都在20%以上，测量重复性差。当微生物处于较大（24 000 CFU/mL）或较小浓度（2 400 CFU/mL）时，测量结果的相对极差分别达到27%和39%，这表明该检测方法在喷气燃料中的微生物浓度较大（20 000 CFU/mL）或较小（2 500 CFU/mL）时，1 mL萃取液在喷气燃料中无法均匀有效地将其中的微生物萃取出来，从而造成检测结果偏差较大。

    3.3  HY-LiTE? JET A1燃料试验的人工振荡效果分析

    不同的操作人员，由于振荡频率、振荡幅度和振荡方向不同，萃取的程度也有所不同。检测结果见表4。

    从表4中可以看出，男操作员力度比女操作员要大一些，因此测量数值更接近于真值（1 mL局限青霉标准菌液的荧光值是8 600 RLU），两个男操作员之间和两个女操作员之间也存在着细微差别。男操作员的相对平均偏差是-14.54%，而女操作员的相对平均偏差是-22.09%。因此，HY-LiTE? JET A1燃料试验方法受人为因素影响较大，当菌液真实浓度处在两个门限值（RLU值为1 000和5 000）时，容易产生污染等级判断偏低的结果，给喷气燃料使用带来隐形的安全威胁。

    3.4  振荡器的振荡效果分析

    采用萃取液漩涡振荡器X-Vortex和样品混合振荡器X-Oscillator对振荡标准进行统一，检测结果见表5。从表5中可以看出，振荡器测得结果稳定性要比人工振荡的方法要高，但人工振荡的方法更加接近真值，相对平均偏差只有-13.37%，而通过振荡器振荡的方法，相对平均偏差竟高达-60.04%，因此，人工振荡的方法无论是从经济成本还是萃取效果上，都要优于振荡器方法。

    4  结论和展望

    通过对HY-LiTE? JET A1燃料试验的研究，可以看出喷气燃料中含菌数与 HY-LiTE? JET A1燃料试验检测的荧光值有着良好的线性关系，线性相关系数达96.01%，因此，ATP生物发光法可以用于喷气燃料微生物污染的检测。但是无论是人工振荡还是振荡器振荡， HY-LiTE? JET A1燃料试验测量结果皆有较大误差，萃取效果不高，同时由于知识产权受限和单次检测成本过高（测试笔398元/只），若直接采用HY-LiTE? JET A1燃料试验进行快速检测，无论是成本还是测量准确度均达不到理想效果。

    采用滤膜集菌的方法，可以很好的解决萃取不完全的问题。目前，滤膜集菌技术已经发展得比较成熟。刘弋青[10]、罗祎[11]、嵇志远[12]、Namvar[13]、Parveen[14]等专家学者已经采用了微孔滤膜集菌的方法进行微生物ATP荧光检测，并取得了良好的检测效果。因此可将滤膜集菌方法与ATP荧光法结合，研制具有我国自主知识产权的喷气燃料微生物快速检测设备，目前本课题组已率先开展了此项工作，并与宁波博奥生物科技有限公司研发了第一代仪器（目前正在测试）。因此，基于滤膜集菌的ATP生物荧光法在喷气燃料微生物污染情况的测定上具有十分广泛的应用前景。

    参考文献：

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