应用蛋白质组学技术筛选肾癌生物分子标志物的研究进展

    喻小燕 石星云 陈锋菊

    摘 要：肾癌早期症状不明显，无特异性指症或症状，待确诊时常已转移，易延误诊断。因此，肾癌的早期筛查和诊断至关重要。近年，肿瘤生物标志物已被广泛应用于肿瘤的早期发现、诊断、指导治疗等方面，如肿瘤生物分子标志物肝癌的甲胎蛋白（ AFP）、卵巢癌的 CA125 等。在肿瘤研究领域，应用蛋白质组学技术研究肿瘤生物标志物成为新的热点且已取得许多振奋人心的成果，基于蛋白质组技术的肾癌生物标志物也进行了广泛而深入的研究，本文重点介绍了近年来肾癌早期诊断、发展分期、术后监测等方面的潜在生物标志物，为肾癌的早期诊断和治疗提供更多依据。

    关键词：肾肿瘤;蛋白组学技术;生物标志

    肾癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一，占成人恶性肿瘤的2.2%。肾癌起病隐袭，早期缺乏特异性症状及体征，40%以上的肾癌确诊时已到晚期，5年存活率难以达到10%[1]，但早期肾癌若经过治疗，5年存活率却能高达 89%，因此，肾癌的早期筛查和诊断尤其重要。蛋白质组技术的飞速发展为肾癌生物标志物的研究提供了新的技术平台，广大学者应用高通量、高灵敏度的蛋白质组学技术对肾癌生物标志物进行了广泛而深入的研究，并取得了一定进展。现将这一领域近年发现的潜在生物标志物的研究结果及进展介绍如下。

    1 应用于肾癌诊断的生物标志物

    1.1 烟酰胺N甲基转移酶（nicotin-amide N-methyltransferase，NNMT）

    烟酰胺N甲基转移酶是人体内重要的甲基化酶，是一种依赖性胞质酶，该酶主要存在于细胞质中，正常情况下，其正常表达于人肝脏组织中，而在心、肾等其他组织中表达低。它作为一种重要的酶参与物质新陈代谢，广泛的细胞信号转导过程。机体发生异常时，诱导烟酰胺发生甲基化反应，从而影响细胞代谢和基因表达等，使其功能发生改变。Kim等[2]等采用双向凝胶电泳-质谱技术研究肾细胞癌及其癌旁组织样本时发现，烟酞胺N-甲基转移酶在肾癌组织中表达明显上调，进一步研究发现，在血清中水平也显著上升。在对肾透明细胞癌、非肾透明细胞癌、良性肾肿瘤的分析检测时，发现潜在的肾癌诊断分子生物标志物NNMT，经使用免疫组化和 westernblot 进行进一步验证，证明 NNMT 是所有类型肾癌中最常见的上调蛋白质，分析认为，烟酰胺N甲基转移酶可作为肾细胞癌诊断的独立的血清学标志。在研究中，他们还发现铁蛋白（ferritin）和人神经元特异性烯醇化酶（hNSE）等蛋白在肾癌组织中表达也上调，经分析和研究，它们与肿瘤的发生、发展等密切相关，NNMT联合铁蛋白和人神经元特异性烯醇化酶的共表达可作为肾癌的一种新的血清标志物用于临床诊断，这将为肾癌早期的诊断治疗带来新的曙光。但确切应用价值还需要进一步的临床验证，目前，还没有在临床中广泛应用。

    1.2 血清淀粉样蛋白（serum amyloid A， SAA）

    血清淀粉样蛋白是一种急性反应蛋白，经肝细胞产生后分泌到血清，所以血清SAA的主要来源是肝脏。它是新的促炎性脂肪细胞因子，也是一种炎症信号的触发剂，当机体发生炎症、损伤等时，SAA浓度明显增加，灵敏性高。目前一些研究报道认为SAA不仅与炎症性和急性损伤性疾病等有关，也与慢性疾病如心血管疾病、肿瘤等有关，在这些疾病中SAA表达量上升，并有报道认为不同分子质量的SAA是肾癌、结肠癌、卵巢癌、肺癌等的肿瘤标志物。Wood等[3]采用表面增強激光解吸电离-飞行时间质谱（SELDI-TOF结合MS/MS）技术分析健康志愿者血清和肾细胞癌患者血清时发现，在肾癌术前血清中血清淀粉样蛋白SAA特异性表达量显著增高，多变量分析认为SAA可作为肾癌的潜在肿瘤标志物，也可作为肾癌预后的血清学候选标志。伊力亚尔等[4]应用SELDI-TOF-MS 蛋白质芯片技术分析肾癌手术前后血清蛋白质表达水平的变化，并与SVM等生物信息学相结合，也筛选出血清淀粉样蛋白，联合筛选出的其他四种蛋白质Bel-2 家族细胞凋亡调节蛋白、WAP二硫化四物核心蛋白、Krueppel样因子8、单核细胞趋化蛋白可作为生物标志物，预测肾透明细胞癌的灵敏度为 87.5%（35/40）， 特异度为86.8%（46/53），虽然SAA不是肾癌的特异标志物，但根据其一些规律的变化，如活动期的急剧增加，或者治疗后的降低等，配合血清学检测方法的高灵敏度，我们认为SAA极有可能成为肾癌的血清分子生物标志物，这对早期肾癌的研究、诊断产生重要临床价值。

    1.3 胸苷磷酸化酶（thymidine phosphorvlase，TP）

    胸苷磷酸化酶是由两条多肽链构成的二聚体，它是近年来发现的一种细胞生长因子，在密啶核苷代谢中起重要作用，是嘧啶核苷合成及分解过程中的重要酶，它还能促进血管生成，是促肿瘤微血管生长因子之一。Unwin等[5]应用血清蛋白质组分析技术在肾透明细胞癌患者血清中发现TP在所有的肾癌组织中表达上调，但在正常肾上皮组织中不表达或表达量很低调，经进一步分析发现，认为TP可作为肾癌诊断的特异性的分子。到目前为止，还没有大量的研究证实TP是肾癌的生物标识，但很多研究人员发现在癌组织中的TP表达显著高于癌旁正常组织。胃癌﹑结直肠癌﹑乳腺癌癌组织中TP表达阳性率分别为64.89%，69.31%、81.18%，因此，仍可将TP 可作为一种肿瘤标志物进行监测[6]。

    1.4 结合珠蛋白 （haptoglo-bin，Hp）

    结合珠蛋白又称触珠蛋白，是一种α2 球蛋白，也是酸性糖蛋白，人类的血清及其他体液中广泛存在。主要作用是结合游离的血红素，防止铁和血红蛋白从肾脏中流失，避免对肾脏造成损害。它还是一种急性期时相反应蛋白，当机体处在应激状态时，血液中的结合珠蛋白明显增加，因此认为，对结合珠蛋白含量的动态监测，有益于疾病的诊断和辅助治疗。Zhang Q[7-9]等筛查肾母细胞瘤患儿血清中的生物标志物时联用SELDI-TOF-MS、HPLC、2D-LC-LTQ-MS等技术， 发现了可作为儿童肾母细胞瘤中特定的标志蛋白之一就是结合珠蛋白，它们在儿童早期肾母细胞瘤中表达均偏高。最近有报道通过蛋白质组学技术在肾透明细胞癌早期阶段的血清中又有新的发现，结合珠蛋白的多态性还与铁的代谢平衡相关。近几年，许多研究者发现，结合珠蛋白在其他肿瘤如肺癌、卵巢癌中存在高表达现象，并且与他们疾病的进展程度相关。王冰，朱月蓉等[10]研究性宫颈癌患者与健康者血清时，也发现宫颈癌早期血清含量Hp明显增高，因此，可认为结合珠蛋白可作为恶性肿瘤生物标志物进行观察，但若作为肾癌临床诊断的依据，仍需根据Hp的表型，并联合其他肿瘤生物标志物，进行肾癌的诊断和鉴别。

    2 应用于肾癌发展、分期、治疗及预后的生物标志物

    2.1 S100家族蛋白（S 100 proteins）

    S100家族蛋白是钙离子结合蛋白，是具有EF-手型基序超家族，成员达20多个，相对分子质量较小，在10-12 kD，空间结构较特殊，可以与钙离子产生特异性结合，S100蛋白参与细胞内的增殖、分化、凋亡等多种生物学功能[11]。许多研究发现S100与肾癌进展密切相关，因此而成为研究的热点，它在肾癌的发生、发展、治疗、耐药等过程中均发挥重要的生物学活性和作用。Geissler K等[12]深入研究发现早期肾癌与良性肾脏病变患者、其他泌尿系肿瘤或非癌症患者以及非正常对照组相比较，含有27种独特表达的蛋白质，其中就有钙离子结合蛋白，他们大多数可以与肾透明细胞癌免疫反应失调有关，可用于诊断肾透明细胞癌。Zhang 等[13]通过免疫组化验证证实小型钙离子结合蛋白 S100 家族 S100A8 和 S100A9 是潛在的生物标志物，可用于诊断肾癌和作为潜在的治疗靶点。进一步研究发现，不同肿瘤T分期的RCC患者血清中， S100A8和S100A9表达的变化随着肾癌的 TNM分期升高，S100A8和S100A9蛋白在肾癌中的表达水平显著上升，在Zhang L等[14]的研究中发现也是如此。Gabril M 等[15]研究发现在肾癌中，随着肿瘤分级和分期升高，S100A11在肾癌组织中的表达显著上调，与S100A11低表达的肾癌患者相比，S100A11高表达的患者的预后更差。说明S100A11 还与肾癌的临床分期和预后有关。故可认为随着对S100家族与肾癌的研究不断深入，S100家族有望为肾癌治疗提供新的诊断、治疗、预后分子生物标志物。

    2.2 热休克蛋白（heatshockprotein，HSP）

    热休克蛋白是一类进化上高度保守的蛋白质，是蛋白质分子的分子伴侣，它主要有HSP60、HSP70、HSPI10、HSP90和小分子量HSPs等5个家族。HSP70、HSP90在细胞中含量较广泛且较多，在生理或病理过程中发挥重要作用，在正常情况下，他们的表达受细胞周期调控，但在高热、恶性肿瘤等状况下，热休克蛋白表达量增高，zhang Y等[16]应用iTRAQ标记和LC-MS/MS技术分析肾癌患者和非癌症患者血液样本时，发现差异血清蛋白中上调的就有热休克蛋白70家族的成员HSC71，热休克蛋白在其他肿瘤中也有过表达，有研究发现在乳腺癌中HSP70表达与癌细胞的增殖，分化、分级等相关，还有研究提示食管癌转移与HSP70有关，是一个重要的预后指标。是癌细胞增生的标志，FU等[17]应用蛋白质组技术研究表明，HSP90a诊断肝癌的敏感度和特异度分别为92.7%、91.3%，此外，HSP90a在肝癌组织中的表达与临床分期、病理分级、疗效监测密切相关。可见，HSP70和HSP90与多种肿瘤的演进有关，虽然直至目前，还没有足够的研究证实HSP70和HSP90可作为肾癌分期分级的特异生物分子标志物，但不能否认HSP70和HSP90作为肿瘤生物分子标志物对肾癌患者病情进展的监测、疗效监测等所产生的重要临床意义。

    3 讨论

    肿瘤生物分子标志物，可以预测个人患肿瘤的风险和早期筛查是否患肿瘤;也可以监测肿瘤发展进程、是否复发、或某类药物治疗的敏感性。综上所述，有不少的学者采用蛋白质组技术对肾癌蛋白生物分子标志物进行研究，发现了一些特异性的肾癌标志物可作为早期诊断的候选指标;鉴定了若干跟肾癌发生发展转移治疗相关的蛋白质等，但受限于蛋白质组技术还存在的一些问题，如应用2-DE技术对低丰度蛋白的分辨率较差，可重复性不够等，发现和鉴定的肾癌标志物特异性不够好，敏感度较低，应用于作为肾癌早期诊断、疗效评价、预后判断及其药物筛选研究也不够多，至今，FDA 尚未批准可用于肾癌临床诊断的体液生物标志物。因此，进一步提高蛋白质组学技术及其他相关肿瘤标志物筛选鉴定技术，在探索并筛选出最佳肾癌生物分子标志物或可能的分子标志物组合的同时，对已发现的肾癌生物分子标志物的功能和临床价值进行进一步研究，并应用于诊断、疗效评价、药物筛选仍有巨大潜力和研究空间。

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    基金项目：湖南省高等學校科学研究项目（项目编号：10C0264）

    作者简介：喻小燕（1973—），女，湖南宁乡人，硕士，主要从事蛋白质化学与蛋白质组学研究。