刺五加茎叶的超声辅助提取工艺及抗氧化活性研究

    胡勇超 符群

    

    摘 要：以刺五加茎叶为原料，采用超声辅助醇提法对其有效成分进行提取，以DPPH自由基清除率为评价指标，通过单因素试验和响应面优化试验，研究液料比、超声时间、超声功率、乙醇浓度对其得率和抗氧化活性的影响。结果表明：最佳提取工艺条件为液料比1：30 g/ml，超声功率240w，提取时间50min，乙醇浓度85%，在此条件下提取物DPPH清除率为72.35%。此外，将最佳条件下获得的刺五加茎、叶提取物进行抗氧化活性研究，分别测定其清除DPPH自由基、OH自由基、NO2-离子和还原能力，并与抗氧化剂Vc进行对比分析。结果表明：刺五加茎叶提取物具有体外抗氧化功效，同浓度条件下，抗氧化剂Vc的清除率远远大于刺五加叶和茎提取物，刺五加不同部位醇溶性有效成分对自由基清除能力：叶>茎。

    关键词：刺五加；有效成分；抗氧化

    中图分类号：S567.19；R285.5 文献标识码：A 文章编号：1006-8023（2018）05-0056-07

    Abstract： Acanthopanax senticosus stems and leaves were used as raw material， and its active ingredients were extracted by ultrasonic assisted extraction. The DPPH free radical scavenging rate was used as the evaluation index， the effects of liquid - to - liquid ratio， ultrasonic time， ultrasonic power and ethanol concentration on the yield and antioxidant activity were studied by single factor test and response surface optimization experiment. The results showed that the optimum extraction conditions were as follows： liquid crystal ratio was 1：30 g / ml， ultrasonic power was 240 w， extraction time was 50 min， ethanol concentration was 85%， under which the DPPH removal rate was 72.35%. In addition， the antioxidant activity of stem and leaf extract was determined by the optimum conditions. The DPPH free radical， ·OH radical， NO2-ion and reducing ability were determined and compared with the antioxidant Vc analysis. The results showed that the extracts of acanthopanax senticosus stems and leaves had antioxidant effect in vitro， under the same concentration， the scavenging rate of antioxidant Vc was much higher than that of extracts of acanthopanax senticosus leaves and stems， and the free radical scavenging ability of different parts of acanthopanax senticosus： leaves > stems.

    Keywords： Acanthopanax senticosus； active ingredients； antioxidant

    0 引言

    刺五加是五加科刺五加屬的重要的药用植物，是我国珍贵的中药材，主要分布在我国东北、河北等地。刺五加的根、茎、叶、花和果均可入药，味辛、微苦、性温和无毒[1-2]特性，其药用价值的可利用性强，属于传统中药的一种，含有许多有效化学成分，如刺五加多糖、皂苷以及黄酮等，不仅具有增强机体免疫力、缓解疲劳、抵抗病毒、益气健脾、补肾安神和延缓衰老的功效[3-5]，而且还可以治疗心血管疾病、糖尿病和神经衰弱等症[6]。

    目前，刺五加全国年需求量达几十万吨以上，以刺五加为材料的中药种类普遍较多，现有的制剂已达近10余种，如复方片剂、刺五加苷粉和口服液等，生产这些制剂所用的原料多以刺五加根和果实为主，茎和叶应用的相对较少。有研究表明，刺五加茎叶中的有效成分具有较强的抗氧化活性，若能加以研究开发，将有效的缓解市场上刺五加需求量大及供应日趋紧张的问题[7]。

    本研究以刺五加茎叶为原料，采用超声辅助醇提法对其有效成分进行提取，研究不同提取条件对提取物的得率和抗氧化活性的影响，并分别测定刺五加茎、叶提取物的抗氧化能力，旨在为进一步挖掘刺五加除根和果实之外的其它部位的价值，为今后刺五加资源的深度开发以及为开发刺五加新产品的可行性提供一定的依据。

    1 材料与方法

    1.1 原料与设备

    （1）原料：刺五加茎、刺五加叶（取自萝北林业局林场）；乙醇（天津市光复精细化工研究所）；邻二氮菲（Sigma公司）；抗坏血酸（Sigma公司）；1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH）（Sigma公司）；其它试剂均为分析纯。

    （2）设备：YXD-20K烘箱（广州鑫南方电热设备有限公司）；FW80粉碎机（天津泰斯特）；TGL-16G高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；DK-98-1电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；TU-1810PC紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；FD-1C-50冷冻干燥设备（南京设备有限公司）；FRQ-1006HT超声波清洗机（浙江杭州设备有限公司）；RE-52A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

    1.2 试验方法

    1.2.1 样品处理

    将刺五加茎和刺五加叶筛选，洗净，烘箱烘干，粉碎过60目筛，取筛下物备用。

    1.2.2 刺五加茎叶超声辅助醇提法提取有效成分工艺流程

    提取工艺：刺五加茎叶→粉碎→75%乙醇浸泡→超声提取→离心→取上清液→合并提取液→真空旋转蒸浓缩→冷冻干燥

    称取刺五加茎叶粉碎物5 g，料液比1：30放入锥形瓶中加入75%乙醇浸泡过夜，放入超声清洗机中超声30 min（T=30℃），抽滤得滤液，重复操作三次合并三次提取液，提取液经冷冻干燥后称重，以抗氧化指标（DPPH法）为指标，筛选适宜的提取条件。

    1.2.3 抗氧化指标（DPPH自由基清除率）的测定

    用分析天平称经过冷冻干燥处理后的提取物50 mg，加入500 ml容量瓶中，用80%乙醇定容至刻度，即配制成0.1 mg/ml的样液备用。DPPH以无水乙醇配制，空白样品+DPPH吸光度（A0）测定：移取100μl无水乙醇，加100μl DPPH溶液，置于96孔板小孔内，充分混匀；DPPH+样品液吸光度（A）测定：分别移取一定浓度的样品液100μl，加100μl DPPH溶液，充分混匀；样品液吸光度（A1）测定：移取同样浓度的样品液100μl，加入100μl无水乙醇，混匀，在室温避光反应0.5 h，在517 nm下测定吸光度[8]。

    式中：A0 为100μl无水乙醇+ 100μl DPPH 样液；A为100μl样液+ 100μl DPPH溶液；A1为100μl样液+ 100μl无水乙醇。

    式中：m0 为提取所得的质量，g；m 为刺五加原料的质量，g。

    1.2.4 试验设计

    （1）单因素试验设计

    ①超声功率对总提取物得率及抗氧化性影响

    以料液比1：30，超声时间30 min，乙醇浓度75%，分别设定超声功率为90、150、210、240、300 w，测定总提取物的得率及DPPH清除率，确定最佳超声功率。

    ②超声时间对总提取物得率及抗氧化性影响

    以料液比1：30，超声功率为150 w，乙醇浓度75%，分别设定提取时间20、30、40、50、60 min，测定总提取物的得率及DPPH清除率，确定最佳超声时间。

    ③料液比对总提取物得率及抗氧化性影响

    以超声功率为150 w，提取时间30 min，乙醇浓度75%，分别设定1：10、1：10、1：30、1：40、1：50的料液比，测定总提取物的得率及DPPH清除率，确定最佳料液比。

    ④乙醇浓度对总提取物得率及抗氧化性影响

    以料液比1：30，超声时间30 min，超声功率为150 w，分别设定乙醇浓度65%、70%、75%、80%、85%，测定总提取物的得率及DPPH清除率，确定最佳乙醇浓度。

    （2）响应面试验设计

    根据统计分析软件 Design Expert 7.1，按Box-Behnken中间组合设计原理，进行四因素三水平的响应面分析试验。以DPPH清除率作为响应值，根据单因素实验结果，选择乙醇浓度、超声时间、超声功率、料液比作为的响应面优化的试验点，试验因素水平编码见表1。

    1.3 刺五加醇提物的抗氧化活性研究

    1.3.1 提取物对羟基自由基（·OH）清除能力的測定

    取7支10 ml容量瓶，分别向其中加入1 ml 0.15 mg/ml的1，10-邻二氮菲溶液和3.8 mL pH=7.4的PBS缓冲溶液，混匀，之后加入0.2 mg/ml的Fe2SO4溶液 1.5 ml 摇匀。将配制成0.2 mg/ml的刺五加提取物溶液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 ml分别加入其中的5支试管中，混匀。另外两支试管中不添加刺五加提取物溶液，分别标记为受损伤管和未受损伤管，然后向受损伤管中加入1 ml浓度为0.01%的过氧化氢溶液，而未受损伤管不添加，最后加入蒸馏水定容至刻度，并将未受损伤管之外的6支试管放于37℃的水浴中恒温1 h，并在波长536 nm处测定其吸光度值，从而计算得出·OH的清除率。

    ·OH自由基清除率=（A0-A1）/（A2-A1）

    式中：A0为提取物溶液的吸光度；A1为不加样液的吸光度；A2为试剂空白的吸光度。

    1.3.2 提取物总还原能力测定

    用分析天平称经过冷冻干燥处理后的提取物50 mg，加入500 ml容量瓶中，用80%乙醇定容至刻度，即配制成0.1 mg/ml的样液。用移液管从样液中分别移取体积为0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 ml 于10 ml 容量瓶内，用乙醇配制成浓度分别0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64 mg/ml的刺五加提取物溶液，待用。分别量取2 ml不同质量浓度的样品溶液置于具塞试管中，然后向其中分别加入2.5 ml PBS缓冲液和浓度为1%的铁氰化钾溶液2.5 ml，混匀后将试管放于50℃水浴锅中20 min，再向其中分别加入浓度为2.5 ml 10%的三氯醋酸溶液，后于离心机转速3 000 r/min情况下，离心10 min后，分别取上清液2.5 ml，加入2.5 ml 75%乙醇和0.1%的0.5 ml FeCl3溶液，振荡10 min，在波长700 nm处测定吸光度。以VC为参照。

    1.3.3 提取物对NO2-离子清除能力的测定

    用分析天平称经过冷冻干燥处理后的提取物50 mg，加入500 ml容量瓶中，用80%乙醇定容至刻度，即配制成0.1 mg/ml的樣液。用移液管从提取物溶液中分别移取体积为0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 ml 于10 ml 容量瓶内，用80%乙醇配制成浓度分别为 0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64 mg/ml的刺五加提取物溶液，待用。分别取2 ml不同质量浓度的刺五加提取物溶液于具塞试管中，分别向其中加入1 ml 5?g/ml NaNO2溶液，在37℃水浴30 min，再加入1 ml 0.4%的对氨基苯磺酸，混匀后静置5 min，再加入0.5 ml 0.2%盐酸萘乙二胺，混合均匀后加乙醇定容至25 ml，静置15 min，在521 nm下测定溶液的吸光度。测定各浓度溶液的吸光度记为A1，以2.0 ml乙醇代替样品，操作方法同上，所测得的吸光度为A0。以水溶性VC为参照。

    NO2-离子清除率（%）=（A0 - A1）/A0×100%。

    式中：A0为蒸馏水的吸光度；A1为刺五加提取物溶液的吸光度。

    1.3.4 提取物对DPPH自由基清除能力的测定

    用无水乙醇将DPPH配制成0.3 mmol/l的溶液。用分析天平称经过冷冻干燥处理后的提取物50 mg，加入500 ml容量瓶中，用80%乙醇定容至刻度，即配制成0.1 mg/ml的样液。用移液管从提取物溶液中，分别移取体积为0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 ml于10 ml容量瓶内，用80%乙醇配制成浓度分别为 0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64 mg/ml的刺五加提取物溶液，待用。将配制好的刺五加叶总提液按ABC加入反应溶液（取三组做平行实验），在整个操作过程需避光，加入反应液后摇匀，需密封避光反应30 min，釆用无水乙醇作为空白对照，利用紫外分光光度计在波长515 nm处测定吸光度值。以VC为参照。

    DPPH清除率%=[A-（B-C）]/A×100%。

    式中：A为3 ml无水乙醇+3 ml DPPH溶液；B为3 ml样品溶液+3 ml DPPH溶液；C为3 ml样品溶液+3 ml无水乙醇。

    1.4 统计分析软件

    应用Design-Expert 7.1软件（Stat Ease，Inc，Minneapolis，USA）；Origin7.5软件；Microsoft Excel 2003处理数据。

    2 结果与讨论

    2.1 单因素试验结果

    2.1.1 超声功率对刺五加茎叶醇提物的影响

    采用1.2.3方法，测定刺五加茎叶醇提物得率和清除率随超声功率的变化情况，如图1所示。

    从图1可以看出，在100～240 w的超声功率范围内，随着超声功率的增大，DPPH清除率和醇提物得率快速增加，这是由于较高的超声功率下，超声的空化作用增强，加速了组织细胞的破碎，促进得率的快速上升，得率和清除率出现峰值为15.50%、56.84%，超声功率超过240 w后随功率增加而逐渐降低，可能是由于超声功率过大，空化气泡急剧崩溃闭合，使得空化作用反而降低，导致得率下降并发生降解等结构变化，使清除率也开始下降。由此可以看出清除率和得率在240 w达到最高值，而且比其它值差异显著，因此，选择210～300 w的超声功率作为响应面试验的因素水平。

    2.1.2 超声时间对刺五加茎叶醇提物的影响

    采用1.2.3方法，测定刺五加茎叶醇提物得率和清除率随超声时间的变化情况，如图2所示。

    从图2可以看出，在20～50 min的超声时间范围内，随超声时间的增加，DPPH清除率快速增加。醇提物得率开始随超声时间增加而提高，这是由于超声时间的增加，刺五加茎叶的粉与醇溶液的接触更加充分，得率上升出现峰值11.50%。但是随着时间的延长，超声破碎到达最大溶出物，清除率出现峰值为51.22%。超过40 min后随时间的延长逐渐平缓没有太大变化，在40 min时出现峰值，超声时间50 min后随时间增加而清除率逐渐降低，可能是由于超声时间过长，一些活性成分被破坏或发生聚集，使浸提液粘度增大，扩散的速率降低，影响得率。由此图得出超声时间对二者的最高值比其它值差异显著，因此，选择40～60 min的超声时间作为响应面试验的因素水平。

    2.1.3 料液比对刺五加茎叶醇提物的影响

    采用1.2.3方法，测定刺五加茎叶醇提物得率和清除率随料液比的变化情况，如图3所示。

    从图3可以看出，在1：10～1：30 g/ml的料液比范围内，随料液比的增加，DPPH清除率和醇提物得率快速增加，这是由于当逐渐增加溶液的体积时，溶剂与物料的接触面积也随之增加，从而溶解更多的物质，在1：30 g/ml时出现峰值得率和清除率分别为17.46%、50.46%，之后随料液比增加DPPH清除率逐渐降低，得率趋于稳定，可能是由于增大溶液的体积使一些非活性成分溶解，造成溶出量的增多而导致清除率的降低。且过多的溶剂为后续处理带来麻烦，造成资源的浪费。综上所述，选择1：20～1：40 g/ml的料液比作为响应面试验的因素水平。

    2.1.4 乙醇浓度对刺五加茎叶醇提物的影响

    采用1.2.3方法，测定刺五加叶醇提物得率和清除率随乙醇浓度的变化情况，如图4所示。

    从图4可以看出，在65%～80%范围内，随乙醇浓度的增大，DPPH清除率和醇提物得率快速增加，这是由于一定浓度的醇溶液有可以破坏氢键与疏水键的作用，加速物质的析出，从而提高得率，最高可达11.50%。在80%时出现峰值清除率为62.72%，乙醇浓度达到80%之后随乙醇浓度增加而逐渐降低，这是由于高浓度的醇溶液水分少，降低细胞的通透性，同时高浓度醇易挥发，导致提取量的下降，使得溶出物的清除率降低。综上所述，选择75%～85%的乙醇浓度作为响应面试验的因素水平。

    2.2 响应面试验结果

    根据Box-Behnken试验设计要求，对影响DPPH清除率的關键因素进行29组试验，其中24组为分析因子，5组为零点。以估计误差，结果见表2。对表2中的试验数据进行多元回归拟合，各试验因子对响应值（DPPH清除率%）的影响可通过如下回归方程来表示

    Y=71.98+3.98×A-1.32×B-0.62×C+1.73×D+2.65

    ×A×B-0.96×A×C+0.63×A×D-7.500E-003×B

    ×C-0.15×B×D-2.90×C×D-4.65×A2-10.82×B2

    -7.43×C2-11.87×D2

    为了检验方程的有效性与合理性，对该模型和回归模型系数显著性进行检验及方差分析，结果见表3。

    由表3可知，A、D回归系数的Pr>F值均小于0.05，为显著水平，表明乙醇浓度、液料比对清除DPPH自由基能力均具有明显的影响；而AB、CD的 Pr>F 值小于0. 05，为显著水平，表明乙醇浓度与超声时间的交互作用，液料比与超声功率的交互作用对清除DPPH自由基能力有明显的影响；因素交互项的影响不显著Pr>F值大于0.05，说明该试验的因素交互作用不显著。因而各试验单因素对DPPH清除自由基能力的影响不是简单的线性关系。

    从表3回归方差显著性分析表明，该模型的调整复相关指数AdjR2=0.9742，说明该模型能解释97.42%响应值的变化，模型的Pr值<0.0001，表明模型的回归极显著。失拟项的Pr>F值大于0.05，影响不显著，表明回归方程拟合度良好，失拟因素对方程干扰较小，因此实验得到的回归方程有效性和实用性良好，故可用此回归模型对试验结果进行分析。

    利用响应面分析软件Design Expert 7.1分析其优化试验结果，以DPPH清除率为评价指标，得到最佳工艺条件组合为：液料比为1：31.15 g/ml，超声功率243.59 w，超声时间50.6 min，乙醇浓度为85%，DPPH清除率可达到71.59%。考虑到实际情况，最佳工艺条件修正为：液料比为1：30 g/ml，超声功率240 w，超声时间50 min，乙醇浓度为85%。经三组平行验证试验得出DPPH清除率72.35%，与表中的预测值差别不显著。结果证明，该模型准确，适用于刺五加叶醇提取工艺的优化。

    2.3 刺五加茎叶提取物的抗氧化性测定

    2.3.1 羟基自由基（·OH）清除率

    采用1.3.1方法，测定刺五加茎和叶的醇提物在不同浓度下对羟基自由基清除能力的变化情况如图5所示。

    由图5可知，试验浓度范围内总提物对羟基自由基清除能力均随着浓度的增加而逐渐增强，浓度在0.2～0.5 mg/ml的范围内，总提物清除羟基自由基的能力呈现良好的量效依赖关系，但是浓度达到0.6 mg/ml以后，清除率逐渐变缓，清除能力达到最高。

    2.3.2 总还原能力测定

    采用1.3.2方法，测定刺五加茎和叶的醇提物在不同浓度下总还原能力的变化情况如图6所示。

    样品中的抗氧化成分能将铁氰化钾还原成亚铁氰化钾，亚铁氰化钾再与三价铁离子反应，生成亚铁氰化铁，在700 nm处有吸光度，且吸光度越大，还原能力越强[10-13]。研究证实，一些植物提取物的抗氧化能力与还原能力之间具有良好的相关性，因此还原能力的高低可以作为一种衡量抗氧化能力的指标。由图6可知，在试验的浓度范围内，叶和茎的总提物对铁离子还原力随着浓度的增加而逐渐上升。VC、叶、茎的还原能力与浓度之间呈现出显著的正相关。

    2.3.3 NO2-离子清除能力

    采用1.3.3方法，测定刺五加茎和叶的醇提物在不同浓度下对NO2-离子清除能力的变化情况如图7所示。

    由图7可知，刺五加茎和叶总提物对NO2-离子清除能力均随着浓度的增加而逐渐增强，浓度在0.2～0.4 mg/ml的范围内，总提物对NO2-离子的清除能力呈现良好的剂量依赖关系，但是浓度达到0.5 mg/ml以后，清除率逐渐变缓，清除能力达到最高限度。

    2.3.4 DPPH自由基清除能力

    DPPH 是一种稳定的自由基，其醇溶液为紫色，并且在517 nm下具有最大吸收。DPPH自由基清除能力测定大多数用于植物化学中，可以用来评价提取物清除自由基的能力的指标，在吸光值为517 nm，吸光度水平降低的程度明显，证明样品的抗氧化性效果较好[12-14]。

    由图8可知，刺五加叶和茎的醇提物对DPPH自由基都有一定的清除能力，而且清除能力均随着样液浓度的增加而逐渐增强。在0.2～0.5 mg/ml范围内，对清除DPPH自由基能够呈现良好的量效依赖关系，显示出效果较高的清除DPPH的能力。但是浓度达到0.5 mg/ml以后，VC和叶的清除率逐渐平缓有接近的趋势，清除能力达到最好效果。

    综上所述，刺五加茎叶醇提物有一定的清除自由基的能力：通过测定上述4种体外抗氧化评价试验，可以发现醇提物提取液质量浓度与抗氧化活性呈现出对自由基清除力及还原能力的量效关系，在一定的范围内提取液质量浓度与抗氧化活性呈现出较好的线性关系。通过抗氧化的4个方法的综合分析可知，刺五加不同部位醇溶性有效成分抗氧化性：叶>茎。

    3 结论

    （1）在单因素试验基础上，经响应面优化确定的最佳工艺条件为：液料比为1：31.15 g/ml，超声功率243.59 w，超声时间50.6 min，乙醇浓度为85%，DPPH清除率可达到71.59%。考虑到实际情况，最佳工艺条件修正为：液料比为1：30 g/ml，超声功率240 w，提取时间50 min，乙醇浓度为85%。经三组平行验证试验得出DPPH清除率72.35%。